The group of hypermethylated long noncoding RNA genes is associated with different types of metastasis in ovarian cancer

Full Text

Рак яичников относится к наиболее распространенным и высоколетальным видам рака женской репродуктивной системы в России и за рубежом [1, 2]. По состоянию на 2024 г. в мире диагностируется более 300 тыс. новых случаев рака яичников и ежегодно регистрируется более 200 тыс. неблагоприятных исходов [2]. Опухоли яичников на ранних стадиях характеризуются высокой начальной частотой ответа на стандартную терапию. Однако со временем развивается рецидив, который быстро перерастает в химиорезистентное заболевание. Кроме того, вследствие бессимптомного течения у большинства женщин рак яичников выявляют на поздних стадиях с обширным метастазированием и плохим ответом на химиотерапию, что повышает вероятность неблагоприятного исхода. Помимо лимфогенного и гематогенного метастазирования канцерогенез яичников характеризуется также диссеминацией по брюшине, метастазированием в большой сальник и развитием асцита [3]. Более того, считается, что на момент установления диагноза у большинства больных уже выявляется именно диссеминация по брюшине. Механизм перитонеальной диссеминации мало изучен и продолжает исследоваться, в том числе на морфологическом, цитологическом и иммунологическом уровнях [4–6]. Поиск биомаркеров перитонеального метастазирования опухолей яичников представляет актуальную задачу биомедицины.

За последние две декады утвердилась точка зрения, что в процессах прогрессирования рака главную роль играют не столько генетические нарушения в опухоль-ассоциированных генах, сколько эпигенетические факторы, такие как ДНК-метилирование генов, модификации гистонов, ремоделирование нуклеосом и хроматина, а также регуляторные микроРНК и длинные некодирующие РНК (днРНК) [7, 8]. Эпигенетическим механизмам уверенно отводится центральное место в регуляции биологических процессов в злокачественных новообразованиях. Эпигенетические модификации обратимы и могут повышать фенотипическую пластичность опухолевой клетки и процессов, вовлеченных в метастазирование рака [7]. Показано, что ДНК-метилирование и регуляторные некодирующие РНК могут служить диагностическими и прогностическими биомаркерами, на основе которых разрабатываются новые методы раннего обнаружения и лечения рака [7, 8].

Открытие микроРНК и днРНК стало мощным прорывом в анализе транскриптомов и регуляторных генных сетей в злокачественных опухолях. Можно отметить, что анализу микроРНК в новообразованиях посвящено более 10 000 работ, днРНК – более 4000 работ, при раке яичников роль микроРНК исследована в 455 работах, а днРНК – только в 158 работах (поиск в PubMed проведен авторами 27.02.2024). Установлено, что днРНК участвуют в регуляции генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях и могут непосредственно связываться с матричной РНК (мРНК) или белками, а также с ДНК в области промоторов генов или взаимодействовать с мРНК при посредничестве микроРНК или РНК-связывающих белков [9]. Так, в последовательностях и днРНК, и мРНК могут содержаться сайты для связывания микро- РНК (англ. MiRNA response elements), благодаря которым днРНК могут конкурировать с мРНК за связывание регуляторных микроРНК по механизму конкурентных эндогенных РНК (англ. ceRNA-model), например при раке яичников [10]. Это один из возможных механизмов участия днРНК в регуляции генов, кодирующих белки, при посредничестве микроРНК.

Исследование закономерностей влияния днРНК на транскриптом в целом и на отдельные РНК в клетках опухолей в частности дает информацию о функциях днРНК. Кроме того, в результате выявляются новые биомаркеры прогрессирования рака. Тканеспецифичный характер экспрессии, эффективное обнаружение в жидкостях организма и стабильность определяют высокий потенциал днРНК в качестве биомаркеров для целей диагностики, прогноза и мониторинга рака, а тканевая специфичность днРНК позволяет разрабатывать селективные терапевтические агенты для лечения рака, включая рак яичников [11, 12].

Ранее в наших исследованиях сначала биоинформатически, а затем и экспериментально были идентифицированы 13 генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, MAFG-DT, PLUT/PDX1-AS1, SNHG1, SNHG6, SNHG12, SNHG17, TINCR, TP53TG1, TUG1), гиперметилированных в опухолях яичников [13, 14].

Цель данного исследования – оценить клиническую значимость уровней метилирования 13 генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, MAFG-DT, PLUT/PDX1-AS1, SNHG1, SNHG6, SNHG12, SNHG17, TINCR, TP53TG1, TUG1), ассоциированных с разными типами метастазирования рака яичников, включая лимфогенное, по брюшине, в большой сальник и отдаленные органы.

Материал и методы

Образцы опухолей яичников собраны и охарактеризованы морфологически и клинически в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России в течение 2020–2023 гг. Работа проведена в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации [15], с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности; получено информированное согласие пациентов. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» (протоколы заседаний № 4Б от 24.11.2020 и № 2 от 04.04.2023).

Исследовали образцы больных, которые до операции не получали лучевую, химиотерапию или гормонотерапию. Опухоли были классифицированы в соответствии с TNM (англ. tumor, nodus, and metastasis (опухоль, узел и метастаз) – Международная классификация стадий злокачественных новообразований) Международного противоопухолевого союза и гистологически верифицированы на основании критериев классификации Всемирной организации здравоохранения [16, 17]. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток (не менее 70–80%) проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (3–5 мкм), окрашенных гематоксилином-эозином. Образцы тканей хранили при -70 ^оС. Замороженную в жидком азоте ткань измельчали с помощью гомогенизатора-диспергатора TissueRuptor II (QIAGEN, Германия).

В исследовании использованы 122 парных образца опухолей яичников и гистологически неизмененных тканей яичника (условной нормы), а также 45 макроскопических перитонеальных метастазов. В связи с высокой представленностью перитонеальных (35–38%) и лимфогенных метастазов (7–19%) среди больных с пограничными опухолями яичников (ПОЯ) выборка включала 104 образца злокачественных опухолей яичников и 18 образцов ПОЯ [18]. Клинико-морфологические характеристики 122 исследованных образцов опухолей яичников отражены в табл. 1.

 

Таблица 1. Обобщенные данные по образцам опухолей яичников (N = 122)

Клинико-гистологический параметр	Количество, абс.
Тип опухоли яичников:
пограничная опухоль	18
злокачественная опухоль	104
Гистологический тип:
серозная аденокарцинома	85
эндометриоидная аденокарцинома	15
другие	22
Стадия:
I	26
II	19
III	68
IV	9
Размер и распространенность опухоли:
Т1	26
Т2	21
Т3	75
Степень дифференцировки:
G1	25
G2	31
G3	48
Гематогенное метастазирование:
M0	113
M1	9
Лимфогенное метастазирование:
N0	101
N1–3	21
Диссеминация по брюшине:
нет	77
есть	45
Метастазирование в большой сальник:
нет	61
есть	61
Метастазирование всех типов:
нет	43
есть	79
Наличие асцита:
нет	53
есть	49

 

Высокомолекулярную ДНК выделяли из ткани по стандартной методике фенол-хлороформной очистки. ДНК хранили при -20 ^оС. Качество и концентрацию ДНК определяли по оптической плотности при длине волны 260 нм на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, США).

Анализ уровня метилирования генов днРНК проводили с применением бисульфитной конверсии ДНК и количественной метил-специфичной полимеразной цепной реакции с детекцией в реальном времени, как описано в работах [13, 14]. Использован набор реактивов qPCRmix-HS SYBR по протоколу фирмы «Евроген» (Россия). Амплификацию проводили в системе CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США) в соответствии с прилагаемым к прибору протоколом. Полноту конверсии ДНК определяли с помощью контрольного локуса ACTB с использованием олигонуклеотидов, специфичных к неконвертированной матрице [13, 14]. Для сравнительного анализа эффективности амплификации также применяли локус ACTB с использованием олигонуклеотидов, специфичных к конвертированной матрице [13]. Последовательности олигонуклеотидов и условия проведения полимеразной цепной реакции для генов днРНК приведены в табл. 2. В качестве контроля для неметилированных аллелей использовали коммерческий препарат ДНК #G1471 (Promega, США). В качестве позитивного контроля 100% метилирования использовали коммерческий препарат ДНК #SD1131 (Thermo Fisher Scientific, США).

 

Таблица 2. Праймеры и условия метил-специфичной полимеразной цепной реакции, использованные в данной работе

Ген днРНК / праймер, нуклеотидная последовательность	Длина, п.н.	Температура отжига, ºС
GAS5
MF: CGTTATCGTCGGTATTGGAGGGG	185	60
MR: CGCCCGACGCCTTATCCC
UF: TGTTATTGTTGGTATTGGAGGGGTGAG	179	60
UR: CAACACCTTATCCCCATCTTCTCCA
HOTAIR
MF: CGGGTTTTTATTTTTTCGTTATTGCG	258	54
MR: CGACTACTCTCGCCAAATTTCACTACTTC
UF: TGGGTTTTTATTTTTTTGTTATTGTGTTATTTTG	258	52
UR: CAACTACTCTCACCAAATTTCACTACTTCACAC
LINC00472
MF: AAGGCGTTTTAAGTCGAGGGTA	224	60
MR: AACGACTCCGACAACACACC
UF: AAGGTGTTTTAAGTTGAGGGTAAAG	228	59
UR: AACAACTCCAACAACACACCCAC
LINC00886
MF: CGTGCGATCGTAGTTCGGTAGGTTA	172	60
MR: CGCCGAATTACGCGACGAAA
UF: CGTGCGATCGTAGTTCGGTAGGTTA	181	60
UR: CCTCACCAAATTACACAACAAAATCAACAC
MAFG-DT
MF: CGGATTTTCGGGCGTTTCG	232	60
MR: ATTTCGAATCTACCGCGCAC
UF: TGTGGATTTTTGGGTGTTTTGTTTG	236	60
UR: ATTTCAAATCTACCACACACCC
PLUT
MF: CGGGGATTTGGTATTGTGTGGC	201	60
MR: CTAAACCTAACCTCTTAATACGACCAACCA
UF: TGTTGGAATGTGTATGGGTTTTTGTAAAGTT	339	61
UR: CACAAATACCTAAACCTAACCTCTTAATACAACCA
SNHG1
MF: CGGCGATCGAGGTTTTAGGA	210	60
MR: ACTAACTCACCGACCGCATT
UF: TGGTGATTGAGGTTTTAGGA	210	55
UR: ACTAACTCACCAACCACATT
SNHG6
MF: TTGAGTTATCGCGTTCGGTTT	295	61
MR: CTCTTCCGATACGCGACCC
UF: CTCTTCCAATACACAACCC	295	58
UR: CAAAAACCATAAACCACCCTCC
SNHG12
MF: CGCGTTTAGTAAAATTATATATTAGTGGAAGAGATAAG	239	60
MR: CCCGACGCTAAACCCACGC
UF: TGTGTTTAGTAAAATTATATATTAGTGGAAGAGATAAG	245	56
UR: TCAATACCCAACACTAAACCCACAC
SNHG17
MF: GCGCGAAACGAGCGTA	168	59
MR: CGACGCCCTAACGTCGAATA
UF: TTGGTGTGAAATGAGTGTA	170	57
UR: CAACACCCTAACATCAAATAACA
TINCR
MF: GCGGACGAGGCGTTGTTGTTAT	193	60
MR: CGCTAACGAACAACAACACCGAAC
UF: GTGGATGAGGTGTTGTTGTTATTGTTGATT	194	60
UR: TCACTAACAAACAACAACACCAAACCATC
TP53TG1
MF: TCGTTTCGTGTTTGACGTC	137	55
MR: ACTCATTTAACACCCGACGA
UF: GTTTTGTTTTGTGTTTGATGTT	137	55
UR: ACTCATTTAACACCCAACAAACC
TUG1
MF: CGGGTTTCGGTTTCGTGGTC	199	60
MR: CGACGAAAACGACAACAACACATAATT
UF: TGGTTTTTAAGGATTGGATTGAGGGTAG	159	60
UR: CAACAACAACAAAAACAACAACAACACATAAT

MF/UF и MR/UR – прямые и обратные праймеры к метилированному/неметилированному аллелю соответственно. Олигонуклеотиды подобраны с использованием базы данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ и программы http://www.urogene.org/methprimer2/ c проверкой в программе SeqBuilder Pro, которая входит в пакет программ Lasergene 17.1 компании DNASTAR (США). Для гена TP53TG1 использованы олигонуклеотиды из работы [19]

 

Статистический анализ полученных данных по степени метилирования генов днРНК проводили с применением индекса метилирования, рассчитанного для каждого образца. Для оценки значимости различий использовали непараметрический критерий Манна – Уитни. Различия считали значимыми при р < 0,05. Анализ данных выполняли с помощью пакета статистических программ IBM SPSS Statistics 27 и Microsoft Excel 10; значимость различий между исследуемыми группами оценивали, используя непараметрический U-тест Манна – Уитни для независимых выборок с учетом поправки Бенджамини – Хохберга на множественное сравнение (англ. false discovery rate, FDR); результат считали значимым при p < 0,05, FDR = 0,1. Для контроля FDR при проведении множественных сравнений с применением метода Бенджамини – Хохберга, поскольку SPSS не имеет встроенной функции для прямого расчета FDR по этому методу, была разработана и применена пользовательская процедура с помощью синтаксиса SPSS. Процедура включала следующие этапы: 1) ранжирование p-значений; 2) расчет критических значений для каждого теста; 3) определение значимости на основе сравнения p-значений с критическими значениями; 4) применение правила остановки Бенджамини – Хохберга для определения окончательного набора значимых результатов. Уровень FDR был установлен на 0,1. Корректность процедуры была верифицирована путем сравнения с эталонными расчетами, выполненными в Microsoft Excel.

Результаты

Проведен сравнительный анализ уровней метилирования 13 генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, MAFG-DT, PLUT/PDX1-AS1, SNHG1, SNHG6, SNHG12, SNHG17, TINCR, TP53TG1, TUG1) в 122 образцах опухолевой и гистологически нормальной ткани яичников, охарактеризованных клинически и морфологически (см. табл. 1), в зависимости от наличия разных типов метастазирования. Кроме того, исследованы 45 макроскопических метастазов относительно 45 парных первичных опухолей тех же больных.

При анализе образцов опухолей больных с метастазами в лимфатических узлах относительно образцов опухолей больных без лимфатических метастазов статистически значимое (p < 0,05, FDR = 0,1) повышение уровня метилирования отмечено только для 2 генов днРНК из 13 исследованных – SNHG6 и SNHG12 (табл. 3), для которых связь с метастазами в лимфатические узлы была отмечена также ранее в работе [14].

 

Таблица 3. Уровни метилирования 2 генов днРНК в опухолях больных с метастазами в лимфоузлах и без лимфогенных метастазов

Ген днРНК	Лимфогенное метастазирование	Уровень метилирования, %	Значение p
SNHG6	N0	24,41 [12, 14; 47, 51]	0,044
	N1–3	50,59 [12, 12; 64, 11]
SNHG12	N0	21,42 [7, 49; 37, 34]	0,006
	N1–3	42,95 [37, 38; 48, 84]

Исследованы 21 образец опухолей больных с метастазами в лимфатических узлах и 101 образец опухолей больных без лимфогенных метастазов; приведены медиана (Me) и квартили [Q1; Q3]

 

В образцах опухолей больных с диссеминацией по брюшине показан статистически значимо (p < 0,05, FDR = 0,1) более высокий уровень метилирования 4 генов днРНК: GAS5, LINC00472 и наиболее значимо HOTAIR и TINCR (р = 0,001, FDR = 0,1) (табл. 4). В образцах опухолей больных с метастазированием в большой сальник был статистически значимо более высокий уровень метилирования другого набора из 4 генов днРНК: GAS5, HOTAIR, LINC00886 (p < 0,05, FDR = 0,1) и наиболее значимо LINC00472 (р < 0,001, FDR = 0,1) (табл. 5).

 

Таблица 4. Уровни метилирования 4 генов днРНК в опухолях больных с диссеминацией по брюшине и без таковой

Ген днРНК	Диссеминация по брюшине	Уровень метилирования, %	Значение p
HOTAIR	Нет	4,49 [2, 94; 5, 64]	0,001
	Есть	6,39 [4, 97; 7, 83]
TINCR	Нет	27,16 [5, 86; 47, 55]	0,001
	Есть	45,41 [37, 69; 53, 64]
GAS5	Нет	4,46 [0, 71; 9, 68]	0,026
	Есть	8,60 [6, 72; 9, 60]
LINC00472	Нет	2,14 [0, 88; 5, 44]	0,041
	Есть	5,20 [0, 89; 8, 30]

Исследованы 45 образцов опухолей больных с диссеминацией по брюшине и 77 образцов опухолей больных без диссеминации по брюшине; приведены медиана (Me) и квартили [Q1; Q3]

 

Таблица 5. Уровни метилирования 4 генов днРНК в опухолях больных с метастазами в большом сальнике и без таковых

Ген днРНК	Метастазирование в большой сальник	Уровень метилирования, %	Значение p
HOTAIR	Нет	4,49 [3, 06; 5, 77]	0,003
	Есть	6,30 [4, 78; 7, 83]
GAS5	Нет	4,92 [0, 77; 9, 04]	0,033
	Есть	8,94 [7, 05; 9, 53]
LINC00472	Нет	1,52 [0, 75; 4, 24]	< 0,001
	Есть	6,42 [2, 77; 8, 25]
LINC00886	Нет	6,16 [0, 84; 13, 57]	0,021
	Есть	9,62 [7, 83; 12, 86]

Исследованы 61 образец опухолей больных с метастазами в большом сальнике и 61 образец опухолей больных без метастазов в большом сальнике; приведены медиана (Me) и квартили [Q1; Q3]

 

При анализе образцов опухолей больных с метастазами всех (любых) типов относительно образцов опухолей пациентов без метастазов получен статистически значимо (p < 0,05, FDR = 0,1) более высокий уровень метилирования 7 генов днРНК: GAS5, LINC00886, TINCR, TUG1, HOTAIR, SNHG6, при этом наиболее значимо LINC00472 (р < 0,001, FDR = 0,1), а также обнаружено статистически значимое (p < 0,05, FDR = 0,1) снижение уровня метилирования гена MAFG-DT (табл. 6).

 

Таблица 6. Сравнение уровней метилирования 8 генов днРНК в опухолях больных с метастазами и без таковых в целом с учетом всех типов метастазирования, включая отдаленные метастазы

Ген днРНК	Метастазирование всех типов	Уровень метилирования, %	Значение p
HOTAIR	Нет	4,38 [3, 01; 5, 45]	0,002
	Есть	6,05 [3, 73; 7, 57]
TUG1	Нет	4,66 [0, 71; 5, 52]	0,024
	Есть	5,455 [3, 8; 6, 48]
SNHG6	Нет	16,95 [8, 96; 35, 08]	0,005
	Есть	35,44 [12, 73; 60, 29]
TINCR	Нет	22,84 [6, 05; 47, 87]	0,039
	Есть	44,18 [25, 0; 49, 27]
GAS5	Нет	3,3 [0, 57; 8, 97]	0,022
	Есть	8,44 [2, 08; 9, 64]
LINC00472	Нет	1,4 [0, 71; 2, 78]	< 0,001
	Есть	6,095 [1, 375; 8, 26]
LINC00886	Нет	4,49 [0, 83; 14, 5]	0,046
	Есть	9,5 [6, 34; 12, 84]
MAFG-DT	Нет	5,53 [1, 93; 7, 42]	0,039
	Есть	2,355 [1, 22; 6, 13]

Исследованы 79 образцов опухолей больных с наличием любых метастазов и 43 образца опухолей больных без каких-либо метастазов; приведены медиана (Me) и квартили [Q1; Q3]

 

Связи данных гиперметилированных генов днРНК с гематогенным метастазированием не установлено, очевидно, вследствие малого количества (9) образцов опухолей больных с отдаленными метастазами в исследуемой выборке. Однако данные по метилированию генов днРНК в опухолях больных с отдаленными метастазами были учтены при анализе связи гиперметилированных генов днРНК с учетом всех типов метастазирования (табл. 7).

 

Таблица 7. Сравнение уровней метилирования 4 генов днРНК в макроскопических перитонеальных метастазах относительно парной первичной опухоли

Ген днРНК	Опухоль / макрометастаз	Уровень метилирования, %	Значение p
MAFG-DT	Опухоль	2,41 [1, 26; 4, 96]	< 0,001
	Макрометастаз	6,2 [5, 38; 8, 11]
TP53TG1	Опухоль	2,85 [1, 38; 5, 46]	< 0,001
	Макрометастаз	6,2 [4, 56; 8, 18]
SNHG12	Опухоль	9,16 [7, 67; 23, 82]	0,002
	Макрометастаз	1,88 [0, 23; 18, 26]
LINC00886	Опухоль	8,47 [6, 38; 12, 76]	0,003
	Макрометастаз	6,44 [3, 82; 8, 27]

Исследованы 45 образцов макроскопических перитонеальных метастазов относительно 45 образцов парных первичных опухолей; приведены медиана (Me) и квартили [Q1; Q3]

 

Для перитонеальных макроскопических метастазов по сравнению с парными первичными опухолями обнаружен статистически значимо меньший уровень метилирования LINC00886 и SNHG12 (р ≤ 0,003, FDR = 0,1), что может указывать на активацию днРНК, кодируемых этими генами, при формировании метастатического узла (см. табл. 7). Кроме того, в перитонеальных макроскопических метастазах наблюдается статистически значимо (р < 0,001, FDR = 0,1) более высокий уровень метилирования относительно первичных опухолей для генов MAFG-DT и TP53TG1 (см. табл. 7).

В образцах опухолей больных с наличием асцита относительно образцов больных без асцита получен статистически значимо (p < 0,05, FDR = 0,1) более высокий уровень метилирования 2 генов днРНК: LINC00472 и LINC00886 (табл. 8).

 

Таблица 8. Уровни метилирования 2 генов днРНК в опухолях больных с асцитом и без асцита

Ген днРНК	Наличие асцита	Уровень метилирования, %	Значение p
LINC00472	Нет	1,99 [0, 71; 6, 09]	0,022
	Есть	5,80 [0, 89; 8, 51]
LINC00886	Нет	5,34 [0, 83; 9, 49]	0,022
	Есть	9,04 [4, 96; 12, 75]

Исследованы 49 образцов опухолей больных с наличием асцита и 53 образца опухолей больных без асцита; приведены медиана (Me) и квартили [Q1; Q3]

 

Для генов PLUT/PDX1-AS1, SNHG1 и SNHG17, гиперметилированных в опухолях яичников, не выявлено статистически значимой связи уровня метилирования с метастазированием.

Обсуждение

Проведен анализ уровня метилирования 13 генов днРНК на представительной выборке из 122 образцов опухолей яичников и 45 макроскопических перитонеальных метастазов, что позволило оценить связь 10 генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, MAFG-DT, SNHG6, SNHG12, TINCR, TP53TG1, TUG1) с разными типами метастазирования.

Показано, что гиперметилирование гена днРНК GAS5 (growth arrest specific 5) ассоциировано с перитонеальным метастазированием опухолей яичников – как с диссеминацией по брюшине, так и с метастазированием в сальник. Эти результаты согласуются с данными о супрессорных и антиметастатических функциях днРНК GAS5 в опухолях разных локализаций, включая рак яичников [20, 21]. В недавней работе установлено, что GAS5 может ингибировать метастазирование рака яичников путем подавления экспрессии РНК-связывающего белка, hnRNPK (гетерогенный ядерный рибонуклеопротеид К), в результате ингибирования путей PI3K/AKT/mTOR [22].

Напротив, для генов SNHG6 (small nucleolar RNA host gene 6) и SNHG12 (small nucleolar RNA host gene 6) из семейства днРНК, образовавшихся из генов-хозяев малых ядрышковых РНК, обнаружена связь метилирования с лимфогенным метастазированием. Следует отметить, что в отличие от малых ядрышковых РНК, происходящих из одних интронов, днРНК семейства SNHG (small nucleolar RNA host gene) содержат последовательности как интронов, так и экзонов; всего известно более 30 таких днРНК [23]. Ранее для днРНК SNHG6 и SNHG12 связь с метастазированием была определена при раке яичников и в опухолях других локализаций, но данные были противоречивы [24–26]. Наши результаты, основанные на исследовании метилирования генов днРНК, позволяют предположить супрессорные антиметастатические свойства для днРНК SNHG6 в опухолях яичников, что согласуется с результатами исследования функции SNHG6 в опухолях толстой кишки [24].

Для гена антисмысловой днРНК HOTAIR (HOX transcript antisense RNA) также было обнаружено аберрантное ДНК-метилирование при раке яичников и отмечена его связь с химиорезистентностью [27]. В нашей работе выявлена связь метилирования гена HOTAIR с диссеминацией по брюшине и с метастазированием в большой сальник.

Для межгенной днРНК LINC00472 (long intergenic non-protein coding RNA 472) ранее были определены супрессорные свойства и роль метилирования в инактивации гена этой днРНК в опухолях желудка и молочной железы [28, 29]. Для межгенной днРНК LINC00886 (long intergenic non-protein coding RNA 886) также имелись данные о роли гиперметилирования в снижении экспрессии гена этой днРНК и об участии LINC00886 в подавлении эпителиально-мезенхимального перехода при некоторых видах рака [30, 31]. Нами впервые обнаружена ассоциация метилирования генов LINC00472 и LINC00886 с метастазированием в большой сальник и с образованием асцитической жидкости у больных с опухолями яичников. Наши результаты подтверждают супрессорный характер этих днРНК, установленный для опухолей других локализаций [28–31].

Отметим, что роль днРНК TINCR (terminal differentiation induced ncRNA) в канцерогенезе выявлена при анализе опухолей разных локализаций, но сведения о возможной супрессорной и антиметастатической или онкогенной функции были противоречивы [32, 33]. Роль днРНК TINCR при раке яичников не исследована другими авторами. В настоящей работе нами впервые определено влияние гиперметилирования гена TINCR на диссеминацию опухолей яичников по брюшине, что согласуется с данными о сниженной экспрессии TINCR и возможной супрессорной функции этой днРНК при некоторых видах рака: глиоме, ретинобластоме и раке предстательной железы [33].

В макроскопических перитонеальных мета- стазах при раке яичников нами было обнаружено гиперметилирование генов TP53TG1 и MAFG-DT. Для антисмысловой днРНК MAFG-DT (MAFG divergent transcript, или MAFG-AS1) ранее показаны повышенная экспрессия в опухолях и способность индуцировать эпителиально-мезенхимальный переход, инвазию и миграцию клеток рака яичников [34]. Межгенная днРНК TP53TG1 (tumor protein 53 target 1), как и ее мишень TP53, играет преимущественно супрессорную роль при различных видах рака, например при раке шейки матки [35]. TP53TG1 может подавлять метастазирование желудка и гепатоцеллюлярной карциномы [36, 37]. Обращает на себя внимание, что гиперметилирование генов TP53TG1 и MAFG-DT наблюдается только в макроскопических перитонеальных метастазах, хотя эти гены не повышали уровень метилирования в первичных опухолях яичников; и напротив, отмечено снижение уровня метилирования гена MAFG-DT при тотальном анализе образцов опухолей с любыми типами метастазирования. Таким образом, для определения роли метилирования генов днРНК MAFG-DT и TP53TG1 с противоположными свойствами (онкогенов и опухолевых супрессоров) в колонизации вторичных очагов в брюшине у больных раком яичников нужны дальнейшие исследования.

На основании полученных результатов определены наборы гиперметилированных генов днРНК, ассоциированных с разными типами метастазирования опухолей яичников. Так, с лимфогенным метастазированием оказались связаны 2 гена – SNHG6 и SNHG12, другие 5 генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, TINCR) могут быть вовлечены в перитонеальное метастазирование, включая диссеминацию по брюшине и метастазирование в большой сальник. Повышенное метилирование HOTAIR и TINCR (р = 0,001, FDR = 0,1) в опухоли ассоциировано с диссеминацией по брюшине, а повышенный уровень метилирования гена LINC00472 (р < 0,001, FDR = 0,1) – с метастазированием в большой сальник. Повышенный уровень метилирования генов LINC00472 и LINC00886 в опухолях больных может быть ассоциирован с развитием асцита. Для перитонеальных макроскопических метастазов характерно значимое (р < 0,001, FDR = 0,1) повышение уровня метилирования генов MAFG-DT и TP53TG1, не проявляющих повышенного метилирования в первичных опухолях яичников, а также снижение уровня метилирования LINC00886 и SNHG12.

Настоящее исследование ограничено анализом клинических образцов. Выявленные закономерности в дальнейшем планируется тестировать на клеточных культурах.

Заключение

Впервые проведено сравнение клинической значимости 13 гиперметилированных днРНК и установлено, что 10 генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, MAFG-DT, SNHG6, SNHG12, TINCR, TP53TG1, TUG1) ассоциированы с различными типами метастазирования опухолей данного типа. Определены гены днРНК, связанные с метастазированием в лимфатические узлы (SNHG6 и SNHG12), диссеминацией по брюшине (GAS5, HOTAIR, LINC00472 и TINCR) и метастазированием в большой сальник (GAS5, HOTAIR, LINC00472 и LINC00886). В перитонеальных макроскопических метастазах относительно парных первичных опухолей наблюдаются гиперметилирование MAFG-DT и TP53TG1 и деметилирование LINC00886 и SNHG12. Проведение дальнейших исследований позволит оценить клиническую значимость выявленных в данной работе новых панелей маркеров для эффективного мониторинга течения рака яичников.

Дополнительная информация

Финансирование

Работа выполнена за счет средств Российского научного фонда (грант № 20-15-00368-П).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов

А.М. Бурдённый – дизайн исследования, подбор праймеров, выполнение эксперимента, редактирование статьи; С.С. Лукина – выполнение эксперимента, статистический анализ полученных данных, редактирование статьи; Е.А. Филиппова – статистический анализ полученных данных, оформление таблиц и иллюстраций, обсуждение результатов, участие в редактировании статьи; Н.А. Иванова – выполнение эксперимента, анализ результатов, участие в обсуждении результатов и редактировании статьи; И.В. Пронина – выполнение эксперимента, участие в анализе литературных данных и обсуждении результатов, редактирование статьи; В.И. Логинов – сбор и анализ характеристик клинических образцов, подбор праймеров, редактирование статьи; Т.П. Казубская – сбор и характеристика клинических образцов, участие в обсуждении результатов, редактирование статьи; Д.И. Кушлинский – лечение больных, анализ историй болезни, участие в сопоставлении результатов с клиническими характеристиками пациентов, обсуждение результатов, редактирование статьи; Д.А. Цекатунов – морфологическое исследование опухолей, обсуждение результатов, сопоставление результатов с морфологическими характеристиками опухолей, редактирование статьи; К.И. Жорданиа – сбор и характеристика клинических образцов, обсуждение результатов, редактирование статьи; Э.А. Брага – дизайн исследования, анализ литературы, написание и окончательное редактирование статьи. Все авторы прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией, согласны нести ответственность за все аспекты работы и гарантируют, что ими надлежащим образом были рассмотрены и решены вопросы, связанные с точностью и добросовестностью всех частей работы.

About the authors

Alexey M. Burdenny

Institute of General Pathology and Pathophysiology; N.M. Emanuel Institute for Biochemical Physics

Author for correspondence.
Email: burdennyy@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9398-8075

Cand. of Biol. Sci., Leading Research Fellow, Laboratory of Pathogenomics and Transcriptomics; Junior Research Fellow, Laboratory of Chemical Physics of Bioanalytical Processes

Россия, ul. Baltiyskaya, 8, Moscow, 125315; ul. Kosygina, 4, Moscow, 119334

Svetlana S. Lukina

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: sveta_sergeevna349@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6246-2444

Research Fellow, Laboratory of Pathogenomics and Transcriptomics

Россия, ul. Baltiyskaya, 8, Moscow, 125315

Elena A. Filippova

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: p.lenyxa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7172-0433

PhD, Research Fellow, Laboratory of Pathogenomics and Transcriptomics

Россия, ul. Baltiyskaya, 8, Moscow, 125315

Natalya A. Ivanova

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: nata-i@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-3314-6183

Junior Research Fellow, Laboratory of Pathogenomics and Transcriptomics

Россия, ul. Baltiyskaya, 8, Moscow, 125315

Irina V. Pronina

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: zolly_sten@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0423-7801

Cand. of Biol. Sci., Senior Research Fellow, Laboratory of Pathogenomics and Transcriptomics

Россия, ul. Baltiyskaya, 8, Moscow, 125315

Vitaly I. Loginov

Institute of General Pathology and Pathophysiology; Research Centre for Medical Genetics

Email: loginov7w@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2668-8096

Cand. of Biol. Sci., Leading Research Fellow, Laboratory of Pathogenomics and Transcriptomics; Senior Research Fellow

Россия, ul. Baltiyskaya, 8, Moscow, 125315; ul. Moskvorechye, 1, Moscow, 115522

Tatyana P. Kazubskaya

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: oncogen5@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0001-5856-0017

MD, PhD, Oncogeneticist, Senior Research Fellow, Laboratory of Clinical Oncogenetics

Россия, Kashirskoye shosse, 24, Moscow, 115522

Dmitry N. Kushlinsky

Institute for Advanced Training of Healthcare Specialists Ministry of Health of the Khabarovsk Territory; Regional Clinical Center of Oncology Ministry of Health of the Khabarovsk Territory

Email: drkushlinskiy@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1490-8418

PhD, Associate Professor, Chair of Oncology and Pathomorphological Disciplines; Head of the Department of Gynecological Oncology

Россия, ul. Krasnodarskaya, 9, Khabarovsk, 680009; 680042, Khabarovsk, Voronezhskoe shosse, 164

Dmitry A. Tsekatunov

Regional Clinical Center of Oncology Ministry of Health of the Khabarovsk Territory

Email: mtsekatunov@inbox.ru
ORCID iD: 0009-0007-1561-9681

MD, Pathologist, Head of the Department of Pathological Anatomy

Россия, 680042, Khabarovsk, Voronezhskoe shosse, 164

Kirill I. Zhordania

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: kiazo2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1380-3710

MD, PhD, Professor, Leading Research Fellow, Department of Gynecological Oncology

Россия, Kashirskoye shosse, 24, Moscow, 115522

Eleonora A. Braga

Institute of General Pathology and Pathophysiology; Research Centre for Medical Genetics

Email: eleonora10_45@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5188-4094

Doctor of Biol. Sci., Professor, Head of Laboratory of Pathogenomics and Transcriptomics; Leading Research Fellow

Россия, ul. Baltiyskaya, 8, Moscow, 125315; ul. Moskvorechye, 1, Moscow, 115522

References

Supplementary files