Группа гиперметилированных генов длинных некодирующих РНК ассоциирована с разными типами метастазирования рака яичников

Полный текст

Рак яичников относится к наиболее распространенным и высоколетальным видам рака женской репродуктивной системы в России и за рубежом [1, 2]. По состоянию на 2024 г. в мире диагностируется более 300 тыс. новых случаев рака яичников и ежегодно регистрируется более 200 тыс. неблагоприятных исходов [2]. Опухоли яичников на ранних стадиях характеризуются высокой начальной частотой ответа на стандартную терапию. Однако со временем развивается рецидив, который быстро перерастает в химиорезистентное заболевание. Кроме того, вследствие бессимптомного течения у большинства женщин рак яичников выявляют на поздних стадиях с обширным метастазированием и плохим ответом на химиотерапию, что повышает вероятность неблагоприятного исхода. Помимо лимфогенного и гематогенного метастазирования канцерогенез яичников характеризуется также диссеминацией по брюшине, метастазированием в большой сальник и развитием асцита [3]. Более того, считается, что на момент установления диагноза у большинства больных уже выявляется именно диссеминация по брюшине. Механизм перитонеальной диссеминации мало изучен и продолжает исследоваться, в том числе на морфологическом, цитологическом и иммунологическом уровнях [4–6]. Поиск биомаркеров перитонеального метастазирования опухолей яичников представляет актуальную задачу биомедицины.

За последние две декады утвердилась точка зрения, что в процессах прогрессирования рака главную роль играют не столько генетические нарушения в опухоль-ассоциированных генах, сколько эпигенетические факторы, такие как ДНК-метилирование генов, модификации гистонов, ремоделирование нуклеосом и хроматина, а также регуляторные микроРНК и длинные некодирующие РНК (днРНК) [7, 8]. Эпигенетическим механизмам уверенно отводится центральное место в регуляции биологических процессов в злокачественных новообразованиях. Эпигенетические модификации обратимы и могут повышать фенотипическую пластичность опухолевой клетки и процессов, вовлеченных в метастазирование рака [7]. Показано, что ДНК-метилирование и регуляторные некодирующие РНК могут служить диагностическими и прогностическими биомаркерами, на основе которых разрабатываются новые методы раннего обнаружения и лечения рака [7, 8].

Открытие микроРНК и днРНК стало мощным прорывом в анализе транскриптомов и регуляторных генных сетей в злокачественных опухолях. Можно отметить, что анализу микроРНК в новообразованиях посвящено более 10 000 работ, днРНК – более 4000 работ, при раке яичников роль микроРНК исследована в 455 работах, а днРНК – только в 158 работах (поиск в PubMed проведен авторами 27.02.2024). Установлено, что днРНК участвуют в регуляции генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях и могут непосредственно связываться с матричной РНК (мРНК) или белками, а также с ДНК в области промоторов генов или взаимодействовать с мРНК при посредничестве микроРНК или РНК-связывающих белков [9]. Так, в последовательностях и днРНК, и мРНК могут содержаться сайты для связывания микро- РНК (англ. MiRNA response elements), благодаря которым днРНК могут конкурировать с мРНК за связывание регуляторных микроРНК по механизму конкурентных эндогенных РНК (англ. ceRNA-model), например при раке яичников [10]. Это один из возможных механизмов участия днРНК в регуляции генов, кодирующих белки, при посредничестве микроРНК.

Исследование закономерностей влияния днРНК на транскриптом в целом и на отдельные РНК в клетках опухолей в частности дает информацию о функциях днРНК. Кроме того, в результате выявляются новые биомаркеры прогрессирования рака. Тканеспецифичный характер экспрессии, эффективное обнаружение в жидкостях организма и стабильность определяют высокий потенциал днРНК в качестве биомаркеров для целей диагностики, прогноза и мониторинга рака, а тканевая специфичность днРНК позволяет разрабатывать селективные терапевтические агенты для лечения рака, включая рак яичников [11, 12].

Ранее в наших исследованиях сначала биоинформатически, а затем и экспериментально были идентифицированы 13 генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, MAFG-DT, PLUT/PDX1-AS1, SNHG1, SNHG6, SNHG12, SNHG17, TINCR, TP53TG1, TUG1), гиперметилированных в опухолях яичников [13, 14].

Цель данного исследования – оценить клиническую значимость уровней метилирования 13 генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, MAFG-DT, PLUT/PDX1-AS1, SNHG1, SNHG6, SNHG12, SNHG17, TINCR, TP53TG1, TUG1), ассоциированных с разными типами метастазирования рака яичников, включая лимфогенное, по брюшине, в большой сальник и отдаленные органы.

Материал и методы

Образцы опухолей яичников собраны и охарактеризованы морфологически и клинически в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России в течение 2020–2023 гг. Работа проведена в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации [15], с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности; получено информированное согласие пациентов. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» (протоколы заседаний № 4Б от 24.11.2020 и № 2 от 04.04.2023).

Исследовали образцы больных, которые до операции не получали лучевую, химиотерапию или гормонотерапию. Опухоли были классифицированы в соответствии с TNM (англ. tumor, nodus, and metastasis (опухоль, узел и метастаз) – Международная классификация стадий злокачественных новообразований) Международного противоопухолевого союза и гистологически верифицированы на основании критериев классификации Всемирной организации здравоохранения [16, 17]. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток (не менее 70–80%) проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (3–5 мкм), окрашенных гематоксилином-эозином. Образцы тканей хранили при -70 ^оС. Замороженную в жидком азоте ткань измельчали с помощью гомогенизатора-диспергатора TissueRuptor II (QIAGEN, Германия).

В исследовании использованы 122 парных образца опухолей яичников и гистологически неизмененных тканей яичника (условной нормы), а также 45 макроскопических перитонеальных метастазов. В связи с высокой представленностью перитонеальных (35–38%) и лимфогенных метастазов (7–19%) среди больных с пограничными опухолями яичников (ПОЯ) выборка включала 104 образца злокачественных опухолей яичников и 18 образцов ПОЯ [18]. Клинико-морфологические характеристики 122 исследованных образцов опухолей яичников отражены в табл. 1.

 

Таблица 1. Обобщенные данные по образцам опухолей яичников (N = 122)

Клинико-гистологический параметр	Количество, абс.
Тип опухоли яичников:
пограничная опухоль	18
злокачественная опухоль	104
Гистологический тип:
серозная аденокарцинома	85
эндометриоидная аденокарцинома	15
другие	22
Стадия:
I	26
II	19
III	68
IV	9
Размер и распространенность опухоли:
Т1	26
Т2	21
Т3	75
Степень дифференцировки:
G1	25
G2	31
G3	48
Гематогенное метастазирование:
M0	113
M1	9
Лимфогенное метастазирование:
N0	101
N1–3	21
Диссеминация по брюшине:
нет	77
есть	45
Метастазирование в большой сальник:
нет	61
есть	61
Метастазирование всех типов:
нет	43
есть	79
Наличие асцита:
нет	53
есть	49

 

Высокомолекулярную ДНК выделяли из ткани по стандартной методике фенол-хлороформной очистки. ДНК хранили при -20 ^оС. Качество и концентрацию ДНК определяли по оптической плотности при длине волны 260 нм на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, США).

Анализ уровня метилирования генов днРНК проводили с применением бисульфитной конверсии ДНК и количественной метил-специфичной полимеразной цепной реакции с детекцией в реальном времени, как описано в работах [13, 14]. Использован набор реактивов qPCRmix-HS SYBR по протоколу фирмы «Евроген» (Россия). Амплификацию проводили в системе CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США) в соответствии с прилагаемым к прибору протоколом. Полноту конверсии ДНК определяли с помощью контрольного локуса ACTB с использованием олигонуклеотидов, специфичных к неконвертированной матрице [13, 14]. Для сравнительного анализа эффективности амплификации также применяли локус ACTB с использованием олигонуклеотидов, специфичных к конвертированной матрице [13]. Последовательности олигонуклеотидов и условия проведения полимеразной цепной реакции для генов днРНК приведены в табл. 2. В качестве контроля для неметилированных аллелей использовали коммерческий препарат ДНК #G1471 (Promega, США). В качестве позитивного контроля 100% метилирования использовали коммерческий препарат ДНК #SD1131 (Thermo Fisher Scientific, США).

 

Таблица 2. Праймеры и условия метил-специфичной полимеразной цепной реакции, использованные в данной работе

Ген днРНК / праймер, нуклеотидная последовательность	Длина, п.н.	Температура отжига, ºС
GAS5
MF: CGTTATCGTCGGTATTGGAGGGG	185	60
MR: CGCCCGACGCCTTATCCC
UF: TGTTATTGTTGGTATTGGAGGGGTGAG	179	60
UR: CAACACCTTATCCCCATCTTCTCCA
HOTAIR
MF: CGGGTTTTTATTTTTTCGTTATTGCG	258	54
MR: CGACTACTCTCGCCAAATTTCACTACTTC
UF: TGGGTTTTTATTTTTTTGTTATTGTGTTATTTTG	258	52
UR: CAACTACTCTCACCAAATTTCACTACTTCACAC
LINC00472
MF: AAGGCGTTTTAAGTCGAGGGTA	224	60
MR: AACGACTCCGACAACACACC
UF: AAGGTGTTTTAAGTTGAGGGTAAAG	228	59
UR: AACAACTCCAACAACACACCCAC
LINC00886
MF: CGTGCGATCGTAGTTCGGTAGGTTA	172	60
MR: CGCCGAATTACGCGACGAAA
UF: CGTGCGATCGTAGTTCGGTAGGTTA	181	60
UR: CCTCACCAAATTACACAACAAAATCAACAC
MAFG-DT
MF: CGGATTTTCGGGCGTTTCG	232	60
MR: ATTTCGAATCTACCGCGCAC
UF: TGTGGATTTTTGGGTGTTTTGTTTG	236	60
UR: ATTTCAAATCTACCACACACCC
PLUT
MF: CGGGGATTTGGTATTGTGTGGC	201	60
MR: CTAAACCTAACCTCTTAATACGACCAACCA
UF: TGTTGGAATGTGTATGGGTTTTTGTAAAGTT	339	61
UR: CACAAATACCTAAACCTAACCTCTTAATACAACCA
SNHG1
MF: CGGCGATCGAGGTTTTAGGA	210	60
MR: ACTAACTCACCGACCGCATT
UF: TGGTGATTGAGGTTTTAGGA	210	55
UR: ACTAACTCACCAACCACATT
SNHG6
MF: TTGAGTTATCGCGTTCGGTTT	295	61
MR: CTCTTCCGATACGCGACCC
UF: CTCTTCCAATACACAACCC	295	58
UR: CAAAAACCATAAACCACCCTCC
SNHG12
MF: CGCGTTTAGTAAAATTATATATTAGTGGAAGAGATAAG	239	60
MR: CCCGACGCTAAACCCACGC
UF: TGTGTTTAGTAAAATTATATATTAGTGGAAGAGATAAG	245	56
UR: TCAATACCCAACACTAAACCCACAC
SNHG17
MF: GCGCGAAACGAGCGTA	168	59
MR: CGACGCCCTAACGTCGAATA
UF: TTGGTGTGAAATGAGTGTA	170	57
UR: CAACACCCTAACATCAAATAACA
TINCR
MF: GCGGACGAGGCGTTGTTGTTAT	193	60
MR: CGCTAACGAACAACAACACCGAAC
UF: GTGGATGAGGTGTTGTTGTTATTGTTGATT	194	60
UR: TCACTAACAAACAACAACACCAAACCATC
TP53TG1
MF: TCGTTTCGTGTTTGACGTC	137	55
MR: ACTCATTTAACACCCGACGA
UF: GTTTTGTTTTGTGTTTGATGTT	137	55
UR: ACTCATTTAACACCCAACAAACC
TUG1
MF: CGGGTTTCGGTTTCGTGGTC	199	60
MR: CGACGAAAACGACAACAACACATAATT
UF: TGGTTTTTAAGGATTGGATTGAGGGTAG	159	60
UR: CAACAACAACAAAAACAACAACAACACATAAT

MF/UF и MR/UR – прямые и обратные праймеры к метилированному/неметилированному аллелю соответственно. Олигонуклеотиды подобраны с использованием базы данных https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ и программы http://www.urogene.org/methprimer2/ c проверкой в программе SeqBuilder Pro, которая входит в пакет программ Lasergene 17.1 компании DNASTAR (США). Для гена TP53TG1 использованы олигонуклеотиды из работы [19]

 

Статистический анализ полученных данных по степени метилирования генов днРНК проводили с применением индекса метилирования, рассчитанного для каждого образца. Для оценки значимости различий использовали непараметрический критерий Манна – Уитни. Различия считали значимыми при р < 0,05. Анализ данных выполняли с помощью пакета статистических программ IBM SPSS Statistics 27 и Microsoft Excel 10; значимость различий между исследуемыми группами оценивали, используя непараметрический U-тест Манна – Уитни для независимых выборок с учетом поправки Бенджамини – Хохберга на множественное сравнение (англ. false discovery rate, FDR); результат считали значимым при p < 0,05, FDR = 0,1. Для контроля FDR при проведении множественных сравнений с применением метода Бенджамини – Хохберга, поскольку SPSS не имеет встроенной функции для прямого расчета FDR по этому методу, была разработана и применена пользовательская процедура с помощью синтаксиса SPSS. Процедура включала следующие этапы: 1) ранжирование p-значений; 2) расчет критических значений для каждого теста; 3) определение значимости на основе сравнения p-значений с критическими значениями; 4) применение правила остановки Бенджамини – Хохберга для определения окончательного набора значимых результатов. Уровень FDR был установлен на 0,1. Корректность процедуры была верифицирована путем сравнения с эталонными расчетами, выполненными в Microsoft Excel.

Результаты

Проведен сравнительный анализ уровней метилирования 13 генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, MAFG-DT, PLUT/PDX1-AS1, SNHG1, SNHG6, SNHG12, SNHG17, TINCR, TP53TG1, TUG1) в 122 образцах опухолевой и гистологически нормальной ткани яичников, охарактеризованных клинически и морфологически (см. табл. 1), в зависимости от наличия разных типов метастазирования. Кроме того, исследованы 45 макроскопических метастазов относительно 45 парных первичных опухолей тех же больных.

При анализе образцов опухолей больных с метастазами в лимфатических узлах относительно образцов опухолей больных без лимфатических метастазов статистически значимое (p < 0,05, FDR = 0,1) повышение уровня метилирования отмечено только для 2 генов днРНК из 13 исследованных – SNHG6 и SNHG12 (табл. 3), для которых связь с метастазами в лимфатические узлы была отмечена также ранее в работе [14].

 

Таблица 3. Уровни метилирования 2 генов днРНК в опухолях больных с метастазами в лимфоузлах и без лимфогенных метастазов

Ген днРНК	Лимфогенное метастазирование	Уровень метилирования, %	Значение p
SNHG6	N0	24,41 [12, 14; 47, 51]	0,044
	N1–3	50,59 [12, 12; 64, 11]
SNHG12	N0	21,42 [7, 49; 37, 34]	0,006
	N1–3	42,95 [37, 38; 48, 84]

Исследованы 21 образец опухолей больных с метастазами в лимфатических узлах и 101 образец опухолей больных без лимфогенных метастазов; приведены медиана (Me) и квартили [Q1; Q3]

 

В образцах опухолей больных с диссеминацией по брюшине показан статистически значимо (p < 0,05, FDR = 0,1) более высокий уровень метилирования 4 генов днРНК: GAS5, LINC00472 и наиболее значимо HOTAIR и TINCR (р = 0,001, FDR = 0,1) (табл. 4). В образцах опухолей больных с метастазированием в большой сальник был статистически значимо более высокий уровень метилирования другого набора из 4 генов днРНК: GAS5, HOTAIR, LINC00886 (p < 0,05, FDR = 0,1) и наиболее значимо LINC00472 (р < 0,001, FDR = 0,1) (табл. 5).

 

Таблица 4. Уровни метилирования 4 генов днРНК в опухолях больных с диссеминацией по брюшине и без таковой

Ген днРНК	Диссеминация по брюшине	Уровень метилирования, %	Значение p
HOTAIR	Нет	4,49 [2, 94; 5, 64]	0,001
	Есть	6,39 [4, 97; 7, 83]
TINCR	Нет	27,16 [5, 86; 47, 55]	0,001
	Есть	45,41 [37, 69; 53, 64]
GAS5	Нет	4,46 [0, 71; 9, 68]	0,026
	Есть	8,60 [6, 72; 9, 60]
LINC00472	Нет	2,14 [0, 88; 5, 44]	0,041
	Есть	5,20 [0, 89; 8, 30]

Исследованы 45 образцов опухолей больных с диссеминацией по брюшине и 77 образцов опухолей больных без диссеминации по брюшине; приведены медиана (Me) и квартили [Q1; Q3]

 

Таблица 5. Уровни метилирования 4 генов днРНК в опухолях больных с метастазами в большом сальнике и без таковых

Ген днРНК	Метастазирование в большой сальник	Уровень метилирования, %	Значение p
HOTAIR	Нет	4,49 [3, 06; 5, 77]	0,003
	Есть	6,30 [4, 78; 7, 83]
GAS5	Нет	4,92 [0, 77; 9, 04]	0,033
	Есть	8,94 [7, 05; 9, 53]
LINC00472	Нет	1,52 [0, 75; 4, 24]	< 0,001
	Есть	6,42 [2, 77; 8, 25]
LINC00886	Нет	6,16 [0, 84; 13, 57]	0,021
	Есть	9,62 [7, 83; 12, 86]

Исследованы 61 образец опухолей больных с метастазами в большом сальнике и 61 образец опухолей больных без метастазов в большом сальнике; приведены медиана (Me) и квартили [Q1; Q3]

 

При анализе образцов опухолей больных с метастазами всех (любых) типов относительно образцов опухолей пациентов без метастазов получен статистически значимо (p < 0,05, FDR = 0,1) более высокий уровень метилирования 7 генов днРНК: GAS5, LINC00886, TINCR, TUG1, HOTAIR, SNHG6, при этом наиболее значимо LINC00472 (р < 0,001, FDR = 0,1), а также обнаружено статистически значимое (p < 0,05, FDR = 0,1) снижение уровня метилирования гена MAFG-DT (табл. 6).

 

Таблица 6. Сравнение уровней метилирования 8 генов днРНК в опухолях больных с метастазами и без таковых в целом с учетом всех типов метастазирования, включая отдаленные метастазы

Ген днРНК	Метастазирование всех типов	Уровень метилирования, %	Значение p
HOTAIR	Нет	4,38 [3, 01; 5, 45]	0,002
	Есть	6,05 [3, 73; 7, 57]
TUG1	Нет	4,66 [0, 71; 5, 52]	0,024
	Есть	5,455 [3, 8; 6, 48]
SNHG6	Нет	16,95 [8, 96; 35, 08]	0,005
	Есть	35,44 [12, 73; 60, 29]
TINCR	Нет	22,84 [6, 05; 47, 87]	0,039
	Есть	44,18 [25, 0; 49, 27]
GAS5	Нет	3,3 [0, 57; 8, 97]	0,022
	Есть	8,44 [2, 08; 9, 64]
LINC00472	Нет	1,4 [0, 71; 2, 78]	< 0,001
	Есть	6,095 [1, 375; 8, 26]
LINC00886	Нет	4,49 [0, 83; 14, 5]	0,046
	Есть	9,5 [6, 34; 12, 84]
MAFG-DT	Нет	5,53 [1, 93; 7, 42]	0,039
	Есть	2,355 [1, 22; 6, 13]

Исследованы 79 образцов опухолей больных с наличием любых метастазов и 43 образца опухолей больных без каких-либо метастазов; приведены медиана (Me) и квартили [Q1; Q3]

 

Связи данных гиперметилированных генов днРНК с гематогенным метастазированием не установлено, очевидно, вследствие малого количества (9) образцов опухолей больных с отдаленными метастазами в исследуемой выборке. Однако данные по метилированию генов днРНК в опухолях больных с отдаленными метастазами были учтены при анализе связи гиперметилированных генов днРНК с учетом всех типов метастазирования (табл. 7).

 

Таблица 7. Сравнение уровней метилирования 4 генов днРНК в макроскопических перитонеальных метастазах относительно парной первичной опухоли

Ген днРНК	Опухоль / макрометастаз	Уровень метилирования, %	Значение p
MAFG-DT	Опухоль	2,41 [1, 26; 4, 96]	< 0,001
	Макрометастаз	6,2 [5, 38; 8, 11]
TP53TG1	Опухоль	2,85 [1, 38; 5, 46]	< 0,001
	Макрометастаз	6,2 [4, 56; 8, 18]
SNHG12	Опухоль	9,16 [7, 67; 23, 82]	0,002
	Макрометастаз	1,88 [0, 23; 18, 26]
LINC00886	Опухоль	8,47 [6, 38; 12, 76]	0,003
	Макрометастаз	6,44 [3, 82; 8, 27]

Исследованы 45 образцов макроскопических перитонеальных метастазов относительно 45 образцов парных первичных опухолей; приведены медиана (Me) и квартили [Q1; Q3]

 

Для перитонеальных макроскопических метастазов по сравнению с парными первичными опухолями обнаружен статистически значимо меньший уровень метилирования LINC00886 и SNHG12 (р ≤ 0,003, FDR = 0,1), что может указывать на активацию днРНК, кодируемых этими генами, при формировании метастатического узла (см. табл. 7). Кроме того, в перитонеальных макроскопических метастазах наблюдается статистически значимо (р < 0,001, FDR = 0,1) более высокий уровень метилирования относительно первичных опухолей для генов MAFG-DT и TP53TG1 (см. табл. 7).

В образцах опухолей больных с наличием асцита относительно образцов больных без асцита получен статистически значимо (p < 0,05, FDR = 0,1) более высокий уровень метилирования 2 генов днРНК: LINC00472 и LINC00886 (табл. 8).

 

Таблица 8. Уровни метилирования 2 генов днРНК в опухолях больных с асцитом и без асцита

Ген днРНК	Наличие асцита	Уровень метилирования, %	Значение p
LINC00472	Нет	1,99 [0, 71; 6, 09]	0,022
	Есть	5,80 [0, 89; 8, 51]
LINC00886	Нет	5,34 [0, 83; 9, 49]	0,022
	Есть	9,04 [4, 96; 12, 75]

Исследованы 49 образцов опухолей больных с наличием асцита и 53 образца опухолей больных без асцита; приведены медиана (Me) и квартили [Q1; Q3]

 

Для генов PLUT/PDX1-AS1, SNHG1 и SNHG17, гиперметилированных в опухолях яичников, не выявлено статистически значимой связи уровня метилирования с метастазированием.

Обсуждение

Проведен анализ уровня метилирования 13 генов днРНК на представительной выборке из 122 образцов опухолей яичников и 45 макроскопических перитонеальных метастазов, что позволило оценить связь 10 генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, MAFG-DT, SNHG6, SNHG12, TINCR, TP53TG1, TUG1) с разными типами метастазирования.

Показано, что гиперметилирование гена днРНК GAS5 (growth arrest specific 5) ассоциировано с перитонеальным метастазированием опухолей яичников – как с диссеминацией по брюшине, так и с метастазированием в сальник. Эти результаты согласуются с данными о супрессорных и антиметастатических функциях днРНК GAS5 в опухолях разных локализаций, включая рак яичников [20, 21]. В недавней работе установлено, что GAS5 может ингибировать метастазирование рака яичников путем подавления экспрессии РНК-связывающего белка, hnRNPK (гетерогенный ядерный рибонуклеопротеид К), в результате ингибирования путей PI3K/AKT/mTOR [22].

Напротив, для генов SNHG6 (small nucleolar RNA host gene 6) и SNHG12 (small nucleolar RNA host gene 6) из семейства днРНК, образовавшихся из генов-хозяев малых ядрышковых РНК, обнаружена связь метилирования с лимфогенным метастазированием. Следует отметить, что в отличие от малых ядрышковых РНК, происходящих из одних интронов, днРНК семейства SNHG (small nucleolar RNA host gene) содержат последовательности как интронов, так и экзонов; всего известно более 30 таких днРНК [23]. Ранее для днРНК SNHG6 и SNHG12 связь с метастазированием была определена при раке яичников и в опухолях других локализаций, но данные были противоречивы [24–26]. Наши результаты, основанные на исследовании метилирования генов днРНК, позволяют предположить супрессорные антиметастатические свойства для днРНК SNHG6 в опухолях яичников, что согласуется с результатами исследования функции SNHG6 в опухолях толстой кишки [24].

Для гена антисмысловой днРНК HOTAIR (HOX transcript antisense RNA) также было обнаружено аберрантное ДНК-метилирование при раке яичников и отмечена его связь с химиорезистентностью [27]. В нашей работе выявлена связь метилирования гена HOTAIR с диссеминацией по брюшине и с метастазированием в большой сальник.

Для межгенной днРНК LINC00472 (long intergenic non-protein coding RNA 472) ранее были определены супрессорные свойства и роль метилирования в инактивации гена этой днРНК в опухолях желудка и молочной железы [28, 29]. Для межгенной днРНК LINC00886 (long intergenic non-protein coding RNA 886) также имелись данные о роли гиперметилирования в снижении экспрессии гена этой днРНК и об участии LINC00886 в подавлении эпителиально-мезенхимального перехода при некоторых видах рака [30, 31]. Нами впервые обнаружена ассоциация метилирования генов LINC00472 и LINC00886 с метастазированием в большой сальник и с образованием асцитической жидкости у больных с опухолями яичников. Наши результаты подтверждают супрессорный характер этих днРНК, установленный для опухолей других локализаций [28–31].

Отметим, что роль днРНК TINCR (terminal differentiation induced ncRNA) в канцерогенезе выявлена при анализе опухолей разных локализаций, но сведения о возможной супрессорной и антиметастатической или онкогенной функции были противоречивы [32, 33]. Роль днРНК TINCR при раке яичников не исследована другими авторами. В настоящей работе нами впервые определено влияние гиперметилирования гена TINCR на диссеминацию опухолей яичников по брюшине, что согласуется с данными о сниженной экспрессии TINCR и возможной супрессорной функции этой днРНК при некоторых видах рака: глиоме, ретинобластоме и раке предстательной железы [33].

В макроскопических перитонеальных мета- стазах при раке яичников нами было обнаружено гиперметилирование генов TP53TG1 и MAFG-DT. Для антисмысловой днРНК MAFG-DT (MAFG divergent transcript, или MAFG-AS1) ранее показаны повышенная экспрессия в опухолях и способность индуцировать эпителиально-мезенхимальный переход, инвазию и миграцию клеток рака яичников [34]. Межгенная днРНК TP53TG1 (tumor protein 53 target 1), как и ее мишень TP53, играет преимущественно супрессорную роль при различных видах рака, например при раке шейки матки [35]. TP53TG1 может подавлять метастазирование желудка и гепатоцеллюлярной карциномы [36, 37]. Обращает на себя внимание, что гиперметилирование генов TP53TG1 и MAFG-DT наблюдается только в макроскопических перитонеальных метастазах, хотя эти гены не повышали уровень метилирования в первичных опухолях яичников; и напротив, отмечено снижение уровня метилирования гена MAFG-DT при тотальном анализе образцов опухолей с любыми типами метастазирования. Таким образом, для определения роли метилирования генов днРНК MAFG-DT и TP53TG1 с противоположными свойствами (онкогенов и опухолевых супрессоров) в колонизации вторичных очагов в брюшине у больных раком яичников нужны дальнейшие исследования.

На основании полученных результатов определены наборы гиперметилированных генов днРНК, ассоциированных с разными типами метастазирования опухолей яичников. Так, с лимфогенным метастазированием оказались связаны 2 гена – SNHG6 и SNHG12, другие 5 генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, TINCR) могут быть вовлечены в перитонеальное метастазирование, включая диссеминацию по брюшине и метастазирование в большой сальник. Повышенное метилирование HOTAIR и TINCR (р = 0,001, FDR = 0,1) в опухоли ассоциировано с диссеминацией по брюшине, а повышенный уровень метилирования гена LINC00472 (р < 0,001, FDR = 0,1) – с метастазированием в большой сальник. Повышенный уровень метилирования генов LINC00472 и LINC00886 в опухолях больных может быть ассоциирован с развитием асцита. Для перитонеальных макроскопических метастазов характерно значимое (р < 0,001, FDR = 0,1) повышение уровня метилирования генов MAFG-DT и TP53TG1, не проявляющих повышенного метилирования в первичных опухолях яичников, а также снижение уровня метилирования LINC00886 и SNHG12.

Настоящее исследование ограничено анализом клинических образцов. Выявленные закономерности в дальнейшем планируется тестировать на клеточных культурах.

Заключение

Впервые проведено сравнение клинической значимости 13 гиперметилированных днРНК и установлено, что 10 генов днРНК (GAS5, HOTAIR, LINC00472, LINC00886, MAFG-DT, SNHG6, SNHG12, TINCR, TP53TG1, TUG1) ассоциированы с различными типами метастазирования опухолей данного типа. Определены гены днРНК, связанные с метастазированием в лимфатические узлы (SNHG6 и SNHG12), диссеминацией по брюшине (GAS5, HOTAIR, LINC00472 и TINCR) и метастазированием в большой сальник (GAS5, HOTAIR, LINC00472 и LINC00886). В перитонеальных макроскопических метастазах относительно парных первичных опухолей наблюдаются гиперметилирование MAFG-DT и TP53TG1 и деметилирование LINC00886 и SNHG12. Проведение дальнейших исследований позволит оценить клиническую значимость выявленных в данной работе новых панелей маркеров для эффективного мониторинга течения рака яичников.

Дополнительная информация

Финансирование

Работа выполнена за счет средств Российского научного фонда (грант № 20-15-00368-П).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов

А.М. Бурдённый – дизайн исследования, подбор праймеров, выполнение эксперимента, редактирование статьи; С.С. Лукина – выполнение эксперимента, статистический анализ полученных данных, редактирование статьи; Е.А. Филиппова – статистический анализ полученных данных, оформление таблиц и иллюстраций, обсуждение результатов, участие в редактировании статьи; Н.А. Иванова – выполнение эксперимента, анализ результатов, участие в обсуждении результатов и редактировании статьи; И.В. Пронина – выполнение эксперимента, участие в анализе литературных данных и обсуждении результатов, редактирование статьи; В.И. Логинов – сбор и анализ характеристик клинических образцов, подбор праймеров, редактирование статьи; Т.П. Казубская – сбор и характеристика клинических образцов, участие в обсуждении результатов, редактирование статьи; Д.И. Кушлинский – лечение больных, анализ историй болезни, участие в сопоставлении результатов с клиническими характеристиками пациентов, обсуждение результатов, редактирование статьи; Д.А. Цекатунов – морфологическое исследование опухолей, обсуждение результатов, сопоставление результатов с морфологическими характеристиками опухолей, редактирование статьи; К.И. Жорданиа – сбор и характеристика клинических образцов, обсуждение результатов, редактирование статьи; Э.А. Брага – дизайн исследования, анализ литературы, написание и окончательное редактирование статьи. Все авторы прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией, согласны нести ответственность за все аспекты работы и гарантируют, что ими надлежащим образом были рассмотрены и решены вопросы, связанные с точностью и добросовестностью всех частей работы.

Об авторах

Алексей Михайлович Бурдённый

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»; ФГБУН Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: burdennyy@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9398-8075

канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории патогеномики и транскриптомики; мл. науч. сотр. лаборатории химической физики биоаналитических процессов

Россия, 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8; 119334, г. Москва, ул. Косыгина, 4

Светлана Сергеевна Лукина

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»

Email: sveta_sergeevna349@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6246-2444

науч. сотр. лаборатории патогеномики и транскриптомики

Россия, 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8

Елена Александровна Филиппова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»

Email: p.lenyxa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7172-0433

канд. мед. наук, науч. сотр. лаборатории патогеномики и транскриптомики

Россия, 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8

Наталья Анатольевна Иванова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»

Email: nata-i@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-3314-6183

мл. науч. сотр. лаборатории патогеномики и транскриптомики

Россия, 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8

Ирина Валерьевна Пронина

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»

Email: zolly_sten@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0423-7801

канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории патогеномики и транскриптомики

Россия, 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8

Виталий Игоревич Логинов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»; ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова»

Email: loginov7w@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2668-8096

канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории патогеномики и транскриптомики; ст. науч. сотр.

Россия, 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8; 115522, г. Москва, ул. Москворечье, 1

Татьяна Павловна Казубская

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: oncogen5@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0001-5856-0017

д-р мед. наук, врач-онкогенетик высшей категории, ст. науч. сотр. лаборатории клинической онкогенетики

Россия, 115522, г. Москва, Каширское шоссе, 24

Дмитрий Николаевич Кушлинский

КГБОУ ДПО «Институт повышения квалификации специалистов здравоохранения» Минздрава Хабаровского края; КГБУЗ «Краевой клинический центр онкологии» Минздрава Хабаровского края

Email: drkushlinskiy@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1490-8418

канд. мед. наук, доцент кафедры онкологии и патоморфологических дисциплин; заведующий отделением онкогинекологии

Россия, 680009, г. Хабаровск, ул. Краснодарская, 9; 680042, г. Хабаровск, Воронежское шоссе, 164

Дмитрий Анатольевич Цекатунов

КГБУЗ «Краевой клинический центр онкологии» Минздрава Хабаровского края

Email: mtsekatunov@inbox.ru
ORCID iD: 0009-0007-1561-9681

врач-патологоанатом, заведующий отделением патологической анатомии

Россия, 680042, г. Хабаровск, Воронежское шоссе, 164

Кирилл Иосифович Жорданиа

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: kiazo2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1380-3710

д-р мед. наук, профессор, ведущий научный сотрудник отделения онкогинекологии

Россия, 115522, г. Москва, Каширское шоссе, 24

Элеонора Александровна Брага

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»; ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова»

Email: eleonora10_45@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5188-4094

д-р биол. наук, профессор, заведующая лабораторией патогеномики и транскриптомики; вед. науч. сотр.

Россия, 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8; 115522, г. Москва, ул. Москворечье, 1

Список литературы

Дополнительные файлы