Том 46, № 8 (2018)

Актуальность. Ранее мы показали, что экспрессия генов FAS, TNFR2, TRAIL, DR3, DR4/5 у больных с впервые выявленным хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) коррелирует с клиническими проявлениями болезни: они минимальны у пациентов с высокой активностью проапоптотических генов и низкой активностью генов, блокирующих апоптоз, и более выражены у пациентов с высоким уровнем экспрессии антиапоптотических и низким уровнем экспрессии проапоптотических генов.

Цель – сравнить уровни экспрессии генов внешнего пути апоптоза у больных с впервые выявленным ХЛЛ до и после проведения курса химиотерапии комбинацией флударабина, циклофосфамида и ритуксимаба (FCR) с учетом исходных клинических данных и ответа на лечение.

Материал и методы. В проспективное одноцентровое когортное исследование включены 23 больных с впервые выявленным ХЛЛ, проходивших клинико-диагностическое обследование и лечение в период с ноября 2014 по декабрь 2017 г. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови для диагностики ХЛЛ проводили методом 4-цветной проточной цитометрии. Для исследования экспрессии генов внешнего пути апоптоза выполняли полимеразную цепную реакцию в реальном времени с обратной транскрипцией. Всем больным применяли стандартную программу лечения FCR с последующим проведением поддерживающего лечения ритуксимабом.

Результаты. Среди 23 больных с впервые выявленным ХЛЛ преобладали мужчины (n = 16). Медиана возраста составила 64 года (от 47 до 77 лет). У 16 пациентов диагностированы I и II стадии ХЛЛ по Rai, у 7 – III и IV стадии. Для удобства анализа пациенты были разделены на 2 группы в зависимости от уровня данного показателя. Перед началом терапии в группе больных с высоким уровнем экспрессии гена FAS по сравнению с пациентами с низким уровнем данного показателя наблюдался более высокий уровень экспрессии генов TNFR2 (p < 0,0015) и TRAIL (p < 0,0053). До проведения FCR-терапии в группе с низким уровнем экспрессии гена FAS количество лимфоцитов было увеличено (р = 0,0016), а эритроцитов снижено (р = 0,0159). Исходно в группе с высоким уровнем экспрессии FAS было больше больных с I и II стадией ХЛЛ (р = 0,0205). Через 3 дня после проведения 4-дневного курса FCR-терапии повышение уровня экспрессии отмечено только для генов FAS (р = 0,0025) и TRAIL (р = 0,0045). По завершении 1-го цикла FCR-терапии у больных с низким уровнем экспрессии гена FAS количество лимфоцитов снижалось быстрее, чем в группе больных с высоким уровнем экспрессии этого гена (р = 0,0019). После 6 циклов FCR-терапии полной или частичной ремиссии достигли 82% (19 из 23 пациентов), при этом у больных с высоким уровнем экспрессии гена FAS было большее количество полных ремиссий (р = 0,026). Нежелательных явлений, связанных с проведением FCR-терапии, не зарегистрировано.

Заключение. Гены внешнего пути апоптоза – один из ключевых факторов опухолевого роста при ХЛЛ. Полученные нами данные о влиянии FCR-терапии на уровень экспрессии генов FAS и TRAIL дают возможность рассматривать их как мишень для данной комбинации препаратов, а также могут лечь в основу разработки новых молекулярных препаратов.

В статье дан обзор современных методов интерференционной микроскопии живых функционирующих клеток, позволяющих на макромолекулярном уровне исследовать динамику субклеточных микроструктур в режиме реального времени с формированием двумерных и трехмерных реконструкций изображения и проведением многопараметрового анализа данных. Показана возможность получения новой диагностической информации в рамках научной методологии так называемого интерактивного диалога с клеткой с целью выявления изменений морфофункционального состояния живых клеток при регистрации их отклика на изменение внешних условий в реальном времени. Описаны физические основы лазерной интерферометрии, проблемы и особенности интерпретации фазовых изображений клеток. В качестве иллюстрации практического использования технологии в условиях клиники представлены собственные результаты исследования морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови у пациентов со злокачественными опухолями ротовой полости и разными стадиями опухолевого процесса. Анализ циркулирующей популяции тромбоцитов с использованием технологии лазерной интерферометрии реального времени позволил выявить наличие компенсированной активации тромбоцитарного звена гемостаза у обследованных больных, зависимость между тяжестью онкологического заболевания и изменением размерных параметров клеток (увеличение средних значений диаметра и площади циркулирующих тромбоцитов на 23,4, 26,8 и 30,3%, и на 30,2, 32,5 и 38,1% у пациентов со II, III и IV стадиями злокачественных опухолей ротовой полости соответственно; p < 0,05 для всех сравнений). Отмечено, что условием масштабирования новых диагностических технологий служит проведение критической оценки эффективности их практической реализации, выявление преимуществ, недостатков и различий между существующими и предлагаемыми диагностическими платформами.

Актуальность. Современные методы клеточной диагностики востребованы при разработке новых подходов персонализированной медицины. К таким методам, активно внедряемым в диагностический процесс лечебных учреждений, можно отнести когерентную фазовую интерферометрию и клеточный микроэлектрофорез.

Цель – обоснование возможности использования биофизических и морфоденситометрических показателей эритроцитов в качестве критериев эффективности терапии и развития адаптационных процессов у пациентов с гастроэнтерологическими заболеваниями.

Материал и методы. Под наблюдением находились 25 больных в возрасте от 40 до 54 лет (11 мужчин и 14 женщин), из них 9 (36%) – с язвенной болезнью желудка, 3 (12%) – с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, 8 (32%) – с острым гастритом, 5 (20%) – с острым панкреатитом. Биофизические и морфологические особенности эритроцитов периферической крови пациентов исследовали до и после проведения терапии с использованием методов клеточной диагностики – микроэлектрофореза и лазерной модуляционной интерференционной микроскопии. Параллельно оценивали динамику рутинных клинико-лабораторных показателей: количество эритроцитов и лейкоцитов, уровень гемоглобина, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), лейкоцитарную формулу. Контрольную группу составили 10 здоровых доноров в возрасте от 36 до 52 лет. В экспериментах in vitro анализировали изменения электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПЭ) и морфологии эритроцитов при действии адреналина и кортизола.

Результаты. После проведения терапии у больных наблюдалось уменьшение содержания лейкоцитов (на 27%), повышение моноцитов (в 2 раза) и снижение СОЭ (на 10%) относительно показателей до лечения (p < 0,05 во всех случаях). ЭФПЭ увеличивалась на 12% (1,37 против 1,22 мкм × см/В × с, p < 0,05). В эритроцитарной популяции обследованных пациентов до лечения по сравнению с контрольной группой отмечалось уменьшение доли дискоцитов (85,2 против 95,4%, р < 0,05), увеличение эхиноцитов, стоматоцитов и дегенеративно измененных форм (11, 2,8 и 1% соответственно, р < 0,05). После терапии содержание дискоцитов повышалось практически до физиологической нормы (91,3%). Однако при этом поверхность клеток дискоидной формы оставалась неоднородной с наличием многочисленных микроспикул, что нашло отражение в изменении электрокинетических и морфологических свойств эритроцитов в ответ на развивающуюся в организме стресс-реакцию. Влияние стресс-реализующих систем подтверждено экспериментами in vitro по оценке воздействия адреналина (1 × 10^-9 г/мл) и кортизола (5 × 10^-7 г/мл) на эритроциты. К 120-й минуте эксперимента под влиянием адреналина наблюдалось снижение ЭФПЭ (1,14 против исходных 1,24 мкм × см/В × с, р < 0,05) и увеличение сферичности клеток. При действии кортизола, напротив, ЭФПЭ увеличивалась (1,72 против 1,36 мкм × см/В × с, р < 0,05), но выраженность эхиноцитарной трансформации была незначительной.

Заключение. Биофизические и морфоденситометрические показатели эритроцитов, полученные с использованием современных экспресс-методов клеточного микроэлектрофореза и когерентной интерференционной микроскопии, объективно отражают интенсивность стресс-реакции при развитии патологического процесса и включение адаптационных механизмов в ходе проводимой терапии.

Актуальность. Применение методов электронной, атомно-силовой и конфокальной микроскопии для скрининга биологически активных соединений, изделий медицинского назначения и экспресс-диагностики ряда заболеваний на клеточном уровне связано с трудоемкой и длительной пробоподготовкой, которая не исключает возможность погрешностей измерений и возникновения артефактов. Этих недостатков лишен метод модуляционной интерференционной микроскопии, позволяющий осуществлять неинвазивные исследования клеточной структуры, получать изображение с нанометровым разрешением и проводить анализ оптических свойств объекта.

Цель – оценить возможность использования метода интерференционной микроскопии при изучении морфофункциональных характеристик ядер клеток в культуре на примере дермальных фибробластов при воздействии митомицином in vitro.

Материал и методы. Нативную культуру дермальных фибробластов человека 6-го пассажа, выращенную на стекле с зеркальным напылением в лаборатории культуры клеток Института экспериментальной медицины и биотехнологий ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, исследовали при помощи модуляционного интерференционного микроскопа МИМ-340 (АО «ПО «УОМЗ», Россия). Оценивали динамику структурных характеристик ядер дермальных фибробластов при воздействии митомицином в условиях in vitro. Контрольную группу составила культура фибробластов, культивированная в аналогичных условиях на стеклах с зеркальным покрытием без добавления митомицина. Исследования на МИМ-340 проводили через 3 часа, 1 сутки и 4 суток после воздействия цитостатиком. Контрольную группу исследовали в те же сроки.

Результаты. Показано, что культура клеток, выращенная на диэлектрических стеклах, по морфофункциональным характеристикам не отличается от культуры, выращенной на культуральном пластике. Тем самым доказана возможность изучения адгезивной культуры в нативном состоянии с использованием интерференционной микроскопии. Установлено, что на однократное воздействие митомицином 0,04% клетки отвечают изменением формы на шаровидную и резким увеличением фазовой толщины ядер (217,8 против 142,18 нм в контрольной группе, p ≤ 0,05). В последующие сроки происходит восстановление морфофункциональных характеристик клеток, что подтверждается динамикой изменений плотности культуры, формы и размеров клеток, а также фазовой толщины ядра.

Заключение. Полученные результаты позволяют рекомендовать метод модуляционной интерференционной микроскопии для изучения токсичности и биосовместимости лекарственных средств, а также изделий медицинского назначения и физических факторов, используемых для диагностики и лечения.

Актуальность. Болезнь Паркинсона (БП) – нейродегенеративное заболевание с преимущественным вовлечением катехоламинпродуцирующих нейронов центральной и периферической нервных систем. Учитывая относительную доступность и низкую стоимость определения концентраций катехоламинов в плазме крови, целесообразно изучение этих показателей для их использования в качестве биомаркеров начальных стадий БП.

Цель – определение и сопоставление плазменных концентраций дофамина (ДА), норадреналина (НА), L-3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) и дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) у здоровых добровольцев и пациентов с начальными стадиями БП при клинически дифференцированных акинетико-ригидной (АРФ) и дрожательной формах (ДФ).

Материал и методы. Проведено наблюдательное одномоментное когортное исследование в период с 2012 по 2015 г. В основную группу посредством сплошного отбора включались пациенты, находившиеся на амбулаторном наблюдении в Республиканском консультативно-диагностическом центре экстрапирамидной патологии и ботулинотерапии (Казань, Россия), с впервые клинически выявленной ранней (I и II стадии по Хен – Яру, 1967) БП разного возраста и пола, ранее не получавшие специфическую противопаркинсоническую терапию. Группу контроля составили относительно здоровые добровольцы без клинических признаков БП с возможными иными хроническими заболеваниями неэкстрапирамидного генеза. Уровни катехоламинов в плазме крови определяли методом жидкостной хроматографии.

Результаты. В основную группу исследования были включены 130 пациентов с впервые установленным диагнозом БП (средний возраст 59,34 ± 8,42 года, 45,38% мужчин), не леченные ранее. Группу контроля составили 56 человек, сопоставимых по возрасту и полу. Распределение пациентов по формам и стадиям БП: ДФ БП – 56,9%, АРФ БП – 43,1%; I стадия – 76,9%, II стадия – 23,1%. В плазме крови пациентов с БП по сравнению с контролем отмечено снижение концентрации НА вне зависимости от формы и стадии (95% доверительный интервал = 124–216 и 248– 428 пкг/мл соответственно, р < 0,026). Уровень ДОФА был снижен только у пациентов с АРФ БП (р = 0,017), уровень ДОФУК – у пациентов со II стадией БП (р = 0,008). Соотношение показателей ДА:НА:ДОФА:ДОФУК составило в среднем 1:32:105:64 в группе контроля против 1:62:238:88 у пациентов с ДФ БП (различие статистически значимо для НА, ДОФА, р < 0,05) и 1:29:96:32 при АРФ БП (p > 0,05). У здоровых добровольцев изменения концентрации ДОФА определяют 84% изменчивости концентраций ДА и НА; взаимосвязи уровня ДОФУК с другими катехоламинами крови не обнаружено. Пациенты с БП, наоборот, вне зависимости от формы и стадии болезни имеют прямую взаимосвязь уровня ДОФУК с уровнем ДА (p < 0,04). У пациентов с ДФ БП сохраняется прямая зависимость плазменных концентраций НА и ДОФА (p < 0,05).

Заключение. Полученные результаты по абсолютным и относительным показателям основного обмена катехоламинов у пациентов с БП начальных стадий поддерживают гипотезу о различном патогенезе дрожательной и акинетико-ригидной форм заболевания.