Neutrophil extracellular traps: molecular and cellular mechanisms of formation, role in the development of placental disorders and preeclampsia

Full Text

Нейтрофильные лейкоциты представляют собой основные, наиболее многочисленные, но короткоживущие клетки гранулоцитарного ряда. Они обеспечивают первый эшелон защитных факторов иммунной системы организма, являясь ключевым клеточным звеном врожденного иммунного ответа. Клетки составляют практически 60–70% лейкоцитов, циркулирующих в кровеносном русле, отличаются высокой скоростью образования (до 5–10 × 10¹⁰ в день) и коротким периодом полураспада (в среднем 6–8 часов) [1, 2].

К каноническим и давно изученным эффекторным функциям нейтрофилов относят фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода (АФК), дегрануляцию и хемотаксис [3, 4]. Однако в последние годы роль этих клеток подверглась пересмотру в связи с появлением новых научных фактов. Установлено, что нейтрофилы играют важную роль не только в борьбе с микроорганизмами (бактерии, грибы, паразиты) при реализации инфекционного иммунитета и воспалительных реакций, но также участвуют в процессах стерильного воспаления, острого повреждения, онкогенеза, аутоиммунитета, способны направлять и регулировать многие реакции адаптивного иммунного ответа, осуществлять специфические интра-, ауто- и паракринные взаимодействия посредством продукции широкого спектра белково-пептидных факторов (про- и противовоспалительных цитокинов, факторов роста, хемоаттрактантов, молекул адгезии и др.) [5–7].

Получены данные, свидетельствующие о выраженной гетерогенности популяции нейтрофильных гранулоцитов по численности отдельных групп клеток, продолжительности их жизни, активности, фенотипу и др. [8, 9]. Обнаружены две отдельные субпопуляции, отличающиеся по денситометрическим параметрам и, соответственно, ряду выполняемых ими функций. Различают нейтрофилы нормальной и низкой плотности, в основе дифференцировки этих субпопуляций лежит разделение в градиенте плотности: клетки нормальной плотности осаждаются вместе с другими полиморфноядерными лейкоцитами; нейтрофилы низкой плотности остаются в слое мононуклеарных клеток. Если функциональный потенциал первых изучен достаточно хорошо, то о функциях нейтрофилов низкой плотности пока известно недостаточно. Считается, что они способны проявлять не только противовоспалительные, но и иммуносупрессивные свойства, а также участвовать в патогенетических механизмах таких заболеваний, как ВИЧ, туберкулез, системная красная волчанка и др. [10–12]. Особое внимание исследователей в контексте получения новых фактов по морфологии, составу и функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов привлекает изучение роли факторов врожденного иммунитета в развитии физиологической беременности и патогенезе гестационных осложнений.

Цель настоящего обзора – анализ отечественных и зарубежных источников научной литературы, посвященных условиям и механизмам формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек, а также их участию в патофизиологии плацентарных нарушений и преэклампсии.

Поиск литературы проводили по базам данных PubMed и РИНЦ (www.elibrary.ru), преимущественно за последние 5 лет, по ключевым словам “neutrophils” + “neutrophil extracellular traps (NETs)” + “pregnancy” / “neutrophil extracellular traps (NETs)” + “placental disorders” / “neutrophil extracellular traps (NETs)” + “preeclampsia”; «нейтрофилы» + «нейтрофильные внеклеточные ловушки» + «беременность» / «нейтрофильные внеклеточные ловушки» + «плацентарные нарушения» / «нейтрофильные внеклеточные ловушки» + «преэклампсия». В основном отечественные и зарубежные работы, касающиеся темы поиска, представлены обзорами по общим аспектам формирования и функционирования ДНК-ловушек. Следует отметить немногочисленность доступных оригинальных статей, в которых авторы подчеркивают, что многие вопросы остаются еще не до конца выясненными и требуют проведения дальнейших исследований в этом актуальном направлении акушерства и гинекологии.

Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NETs)

2004 год стал переломным моментом в длительной истории изучения морфологии и функций нейтрофилов. Ранее ученые выделяли два возможных варианта развития событий после встречи клеток с патогенами: фагоцитоз и экзоцитоз. Впервые в Институте Макса Планка группой немецких исследователей был выявлен и описан новый механизм антимикробной активности нейтрофилов, реализуемый через выбрасывание клеткой во внеклеточное пространство сетеподобной структуры с иммобилизованными на ее волокнах молекулами различных гранулярных белков [13–15]. Обнаруженные экстрацеллюлярные образования авторы назвали нейтрофильными внеклеточными ловушками (англ. neutrophil extracellular traps, NETs), а сам процесс – нетозом.

Процесс формирования ДНК-ловушек начинается в ответ на действие стимулирующих агентов, к которым в первую очередь причисляют микроорганизмы (грамположительные, грамотрицательные бактерии и грибы). Биологическая целесообразность образования NETs обусловлена ситуациями, когда инфекционный агент имеет размеры, превосходящие размеры клетки, и не может подвергнуться фагоцитозу. Следовательно, в качестве стимулов и регуляторов образования NETs могут выступать как размеры микроорганизмов, так и факторы их вирулентности, а также провоспалительные молекулы. Кроме того, в процессе регуляции NETs участвуют и другие стимулирующие агенты, например, различные аутоантитела, иммунные комплексы, компоненты комплемента, кристаллы уратов, мочевой кислоты, холестерина, провоспалительные цитокины (IL-1, 6, 8, TNF-α) [16–18]. Важную роль в инициировании образования ДНК-ловушек играют межклеточные взаимодействия нейтрофилов с эндотелиоцитами и активированными тромбоцитами [19].

Установлено, что морфологические сетевые структуры NETs представлены сложным комплексом, состоящим из деконденсированных нитей хроматина, толщина которых варьирует от 15 до 17 нм, с иммобилизованными разнообразными цитозольными белковыми глобулами диаметром 25–30 нм, включающими молекулы нейтрофильной эластазы (NE), миелопероксидазы (MPO), матриксных металлопротеиназ, лизоцима, лактоферрина, желатиназы, коллагеназы, катапсина G и др. [20, 21]. В составе NETs могут присутствовать также остатки разрушенных в процессе нетоза структур цитоскелета клетки, включая филаменты актина и миозина. Однако при всем разнообразии состава ловушки более 70% составляют гистоны с преобладанием NE и MPO [22, 23]. Площадь сетеподобной внеклеточной структуры нейтрофила с комплексом вышеуказанных компонентов, выбрасываемой во внеклеточное пространство, обычно может превышать размер нейтрофила до 10–15 раз; данные особенности строения и размеров ловушки позволяют ей взаимодействовать с достаточно крупными патогенами, способными уклоняться от фагоцитоза и избегать уничтожения [24, 25]. Именно поэтому выявленную способность нейтрофильных лейкоцитов формировать NETs, выбрасывая во внеклеточное пространство свое содержимое, включая хроматин ДНК, гистоны и гранулированные белки, можно рассматривать как избирательный адаптационный механизм функционирования неспецифического иммунитета и считать началом новой эры в исследовании функций нейтрофильных гранулоцитов [26, 27].

Механизмы и пути нетоза

ДНК-ловушка появляется как следствие фундаментальной реорганизации и дезинтеграции субклеточных структур нейтрофила, связанных с процессами деконденсации хроматина и его гомогенизации с цитозольными компонентами. При последующем их выбросе в межклеточное пространство могут происходить три различных варианта событий:

• выделение ДНК-ловушки (собственно нетоз (англ. NETosis)), которое наблюдается при разрушении цитоплазматической мембраны, деконденсации ядерного хроматина, высвобождении ловушки и сопровождается гибелью клетки, – классическое суицидальное образование NETs (суицидальный нетоз, англ. suicide NETosis) [27, 28];
• формирование ДНК-ловушки по механизму экзоцитоза, то есть при образовании комплекса клеточных ферментов, гистонов и волокон ДНК не нарушается целостность цитоплазматической мембраны и внутриклеточная структура нейтрофила (витальный нетоз, англ. vital NETosis) [28, 29];
• образование ДНК-ловушки из митохондриальной, а не ядерной ДНК (митохондриальный нетоз, англ. mitochondrial NETosis) [28, 30, 31].

Надо отметить, что в варианте несмертельного витального нетоза клетка остается живой и даже функционально активной, но при этом в составе ловушки будут отсутствовать белки цитоскелета и цитоплазматические компоненты. При развитии суицидального нетоза различают Nox-2-зависимый и Nox-2-независимый пути [32].

Инициация нетоза по Nox-2-зависимому пути связана с активацией нейтрофила форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA) через сигнальный каскад с участием протеинкиназы C (PKC) и NADPH-оксидазы 2 (Nox-2), индуцирующий синтез АФК. Повышенное содержание АФК способствует освобождению MPO и NE из азурофильных гранул и их выходу в цитозоль. Под влиянием МРО перекись водорода претерпевает ряд превращений до хлорноватистой кислоты, которая стимулирует NE, вызывает разрушение цитоскелета, плазматической и ядерной оболочек, деконденсацию ядерной ДНК [2, 33].

Для Nox-2-независимого пути основным является повышение уровня внутриклеточного кальция, индуцируемого после стимуляции клеток иономицином или ионофорами кальция. Механизм не до конца расшифрован, но предполагают, что реализуется он без участия АФК через активацию PAD4 (пептидиларгининдеиминазы 4), которая запускает каскад внутриклеточных реакций и катализирует цитруллинирование гистонов, в результате чего происходит деконденсация хроматинового скелета, разрыв ядерной мембраны, высвобождение ядерной ДНК, комплексирование в цитоплазме нитей ДНК с ядерными гистонами, молекулами белков и содержимым гранул нейтрофилов. После разрушения клеточной мембраны генетический материал вместе со смесью белков поступает во внеклеточное пространство [25, 34].

Участие NETs в процессах гемостаза

Исследования последних лет показали, что механизм нетоза тесно связан с процессами коагуляции [35]. При этом участие ловушек в процессах гемостаза может происходить при непосредственном контакте паутинных структур NETs с тромбоцитами и клетками эндотелия по типу «лиганд – рецептор». Взаимодействие между эндотелиоцитами, лейкоцитами и тромбоцитами осуществляется непосредственно через трансмембранные гликопротеины, реализующие реакции клеточной адгезии, путем образования сложного комплекса селектинов Р и Е с высокоаффинным лигандом PSGL-1 на мембране нейтрофила или при опосредованном участии цитокиновых молекул.

Однако не исключен иной вариант событий, при котором основные компоненты NETs (нити ДНК и гистоны) сами способствуют активации тромбоцитов и эндотелиоцитов, осуществляя межклеточные взаимодействия посредством молекул адгезии и клеточного мембранного аппарата [22, 36]. Возможно возникновение и так называемой петли положительной обратной связи, когда гистоны, входящие в состав NETs, активируют тромбоциты, а активированные тромбоциты стимулируют повышенное образование нейтрофильных внеклеточных ловушек.

Кроме этого, в локализованные на поверхности эндотелия NETs могут попадать, задерживаться и накапливаться, помимо тромбоцитов, и другие клетки периферической крови, включая эритроциты и лимфоциты, что способствует образованию некого «каркаса», усиленного волокнами фибрина и фибронектина, на основе которого происходит повышенное тромбообразование [37, 38].

Определенную роль в активации коагуляционного гемостаза играют электростатические взаимодействия. Точный механизм их реализации пока неизвестен, но высказывается мнение, что отрицательно заряженные NETs могут инициировать внешний путь свертывания посредством селективной экспрессии на сетчатых структурах фактора III и непосредственно активировать участников внутреннего пути свертывания – факторы XI и XII [39, 40].

Роль NETs в процессе гестации и родов

Является установленным факт, что при беременности и в родах, которые сопровождаются развитием стерильного воспалительного процесса, регистрируется периферическая нейтрофилия, связанная с увеличением числа циркулирующих нейтрофилов как нормальной, так и низкой плотности [41]. Увеличение доли нейтрофильных лейкоцитов в периферии может происходить вследствие повышенной при беременности продукции костного мозга, нарушения апоптоза клеток и/или системной воспалительной реакции, опосредованной растворимыми продуктами плаценты [42].

В процессе гестации различные триггеры беременности (цитокины, гормоны, колониестимулирующие факторы и др.) способствуют повышенной активности факторов врожденного иммунитета на фоне подавления клеточно-опосредованного иммунного ответа. Наблюдается динамичная миграция лейкоцитов в ткани плацентарного комплекса для осуществления антимикробных функций, а также удаления возможного клеточного мусора [43]. Повышенный активационный статус нейтрофилов периферической крови беременных подтвержден в целом ряде исследований их фенотипа [44, 45].

Во время родов происходит нейтрофильная инфильтрация миометрия на фоне биохимических изменений, связанных со снижением синтеза коллагена, повышением активности коллагеназы, увеличением концентрации провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, IL-6, IL- 8, матриксных металлопротеиназ 8 и 9, которые содержатся в гранулах нейтрофилов, и ряда медиаторов, включая COX-2 и синтазу PGEВ [42, 46].

При преждевременных родах, произошедших до 37 недель беременности, важным аспектом представляется учет их возможных причин, включая инфекции и/или развитие воспаления, что также непосредственным образом связаны с активацией нейтрофильного звена врожденного иммунитета, а именно усилением миграции, адгезии, дегрануляции, фагоцитарной активности клеток. Нейтрофилы активно инфильтрируют шейку матки, матку и плодные оболочки, усиленно продуцируя NETs. По данным проточной цитометрии, гранулоциты в этой ситуации начинают экспрессировать достаточно высокие уровни CD11b, CD15 и CD66 [47–49].

Плацентарные нарушения и NETs

Плацента – уникальный по своему строению и функциям орган плодово-материнского происхождения, необходимый для длительного внутриутробного развития ребенка, который функционирует как сложная транспортная система, направляя питательные вещества для поддержки растущего плода, создавая физический барьер между кровообращением матери и плода, обеспечивая не только питательную, но и дыхательную, выделительную, защитную функции. Поэтому плацентарные нарушения рассматривают как поликаузальный синдром, развивающийся в результате сочетанной реакции плода и плаценты при нарушении молекулярных, клеточных, тканевых и органных адаптационно-гомеостатических реакций фетоплацентарной системы. Считается, что присутствие аберрантных NETs, а также их продуктов, включая АФК, в тканях и сосудах плаценты может оказывать цитотоксический эффект на клетки и ткани, неблагоприятное влияние на плод, способствовать повреждению плаценты, вызывая сосудистые изменения, и провоцировать прерывание беременности [50, 51].

Патофизиология плацентарных нарушений связана с неадекватной инвазией маточных артерий клетками трофобласта и возникновением дефектного потока в межворсинчатом пространстве, что ухудшает усвоение питательных веществ и кислородный обмен, вызывая недостаточность питания и хроническую гипоксию плода [52].

В отличие от здоровой плаценты при прогрессировании плацентарных нарушений патологическая активация эндотелиоцитов вызывает повышенное высвобождение молекул P-селектина и фактора Виллебранда, обусловливающих привлечение и тесное взаимодействие тромбоцитов и нейтрофилов, формирующих каркас построения тромба. Последующая аберрантная продукция NETs может вызывать повреждение спиральных артерий и прогрессирование плацентарных нарушений [53]. При этом не исключено, что высокое содержание внеклеточных нейтрофильных ловушек будет источником провоспалительных и антиангиогенных факторов, передающихся плоду, последствия чего пока неизвестны.

Роль NETS в развитии преэклампсии

Одно из грозных плацентарно-опосредованных осложнений беременности – преэклампсия, в патофизиологии которой основное значение придают процессам воспаления, гипертонии и почечной недостаточности. Несмотря на распространенность заболевания (до 8% беременностей), высокую угрозу потери беременности, материнской и неонатальной смертности, понимание особенностей патогенеза преэклампсии и выбор наиболее эффективной терапевтической тактики остаются одними из основополагающих проблем акушерства и гинекологии.

Именно преэклампсия оказалась первым осложнением беременности, при котором были описаны патофизиологические механизмы активации врожденного иммунитета и образования NETs (таблица).

 

Основные достижения в изучении патофизиологии нейтрофильных внеклеточных ловушек (NETs) при преэклампсии

Автор [источник]	Год публикации	Страна	Результаты
S. Hahn и соавт. [54]	2014	Швейцария	Обнаружили NETs при преэклампсии, установили их связь с тромбозами и риском инфаркта плаценты
K. Egan и соавт. [55]	2015	Ирландия	Описали механизмы, лежащие в основе протромботического фенотипа при преэклампсии с участием NETs
W. Marder и соавт. [56]	2016	США	При гистопатологическом анализе плаценты при преэклампсии количественно определили нейтрофилы и NETs в межворсинчатом пространстве. Показали, что аберрантное образование NETs оказывает токсическое «проапоптотическое» воздействие на трофобласты, нарушает структуру спиральных артерий и процесс плацентации
C. Sur Chowdhury и соавт. [57]	2016	Швейцария	Установили, что комплексы бесклеточной ДНК/миелопероксидазы NETs постепенно увеличиваются на протяжении всей беременности, но наиболее выражены при преэклампсии
B. Konečná и соавт. [58]	2018	Словакия	Показали, что NETs запускают повышенную продукцию провоспалительных цитокинов, что может приводить к аномальным реакциям клеточного и гуморального иммунного ответа и развитию осложнений беременности, в том числе преэклампсии
L. Vokalova и соавт. [59]	2018	Швейцария, Словакия, Венгрия	Установили, что к факторам, способствующим нарушению регуляции активности нейтрофилов и повышенному образованию NETs, относятся гипергликемия и взаимодействие между повышенными уровнями TNFα с сопутствующим снижением его потенциального регулятора A1AT
M. Moodley и соавт. [60, 61]	2020	Южная Африка	Показали избыточное присутствие NETs в межворсинчатом пространстве, окружающем обменные и проводящие ворсинки плацентарной ткани. Предположили, что NETs могут выступать в качестве ранних биомаркеров патологии синцитиотрофобласта плаценты при преэклампсии
M.M. Islam, N. Takeyama [62]	2023	Япония, Бангладеш	Описали возможность повышенного формирования NETs при преэклампсии через IL-8-зависимый механизм. Компоненты NETs в межворсинчатом пространстве плаценты обнаруживали методом иммунофлюоресцентного окрашивания и показали, что обострение нетоза приводит к повреждению плацентарной ткани
F. Guillotin и соавт. [31]	2023	Франция	Описали различные метаболические пути нетоза, связанные с нормальной беременностью и преэклампсией. Доказали, что основным механизмом при преэклампсии служит суицидальный нетоз

 

Суммируя полученные авторами результаты, можно констатировать, что на фоне гормонального дисбаланса индуцированная плацентарными микрочастицами патологическая активация нейтрофильных лейкоцитов через IL-8-зависимый механизм в условиях усиления воспалительных явлений приводит к повышенному высвобождению внеклеточных ловушек, компоненты которых обладают прокоагулянтной и протромботической активностью, что увеличивает риск развития венозной тромбоэмболии у беременной [31, 59–62].

Кроме того, неадекватная иммунная активация в системе «мать – плацента – плод» может способствовать иммуногенным процессам с участием гуморальных и клеточных факторов адаптивного иммунитета, выработке антител против плацентарных и фетальных эпитопов и развитию иммунотромбоза [54, 56, 62]. Иммуноопосредованное повреждение эндотелия вызывает активацию компонентов комплемента, внутреннего и внешнего путей свертывания крови. Нейтрофилы мигрируют к очагам повреждения эндотелия, и через различные (суицидальные/витальные) механизмы нетоза происходит неконтролируемое образование внеклеточных ловушек. В свою очередь, NETs экспрессируют PAD4, способствуя через каскад реакций активации тромбоцитов. Посредством электростатического взаимодействия отрицательно заряженных внеклеточных структур NETs и положительно заряженных гистонов формируется каркас-матрица для прикрепления эритроцитов и тромбоцитов с выстраиванием внутрисосудистого тромба. Образование оси «NETs – тромбоциты – тромбин» индуцирует внутрисосудистое свертывание крови, прогрессирование микрососудистой дисфункции и ишемических изменений в плаценте [63].

Детальные сведения об основных звеньях патогенеза преэклампсии с учетом новых данных по активации и нарушению регуляции NETs могут оказаться полезными для ранней диагностики осложнений беременности и своевременного предотвращения развития нежелательных последствий.

Заключение

С момента открытия NETs получили признание научным сообществом как один из центральных механизмов иммунной регуляции и полноправный участник многообразных физиологических и патологических процессов. Особое внимание, наряду с неоспоримыми защитными антимикробными свойствами внеклеточных нейтрофильных ловушек, привлекает противоречивый аспект их аберрантной активации и неконтролируемой чрезмерной генерации.

Постоянно обновляемые к настоящему времени знания о морфологических и функциональных особенностях клеточного звена врожденного иммунитета диктуют их детальный и закономерный пересмотр, необходимость дальнейшего углубленного исследования с учетом функционального потенциала и условий формирования NETs, уточнения и определения патогенетического значения при течении нормальной и осложненной беременности. Такой подход, несомненно, имеет перспективы в плане разработки многообещающей стратегии для диагностики и прогнозирования течения целого ряда заболеваний, а также новых предложений по эффективному достижению терапевтических целей с использованием таргетной терапии.

Дополнительная информация

Финансирование

Работа проведена без привлечения дополнительного финансирования со стороны третьих лиц в рамках диссертационных исследований.

Конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов

С. А. Гаспарян – концепция и дизайн статьи, редактирование и утверждение итогового варианта текста рукописи; А. Г. Топузов – анализ литературы, написание и редактирование текста; И. А. Орфанова и С. М. Ахмедова – поиск и анализ литературы, обработка исходного материала, написание текста. Все авторы прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией, согласны нести ответственность за все аспекты работы и гарантируют, что ими надлежащим образом были рассмотрены и решены вопросы, связанные с точностью и добросовестностью всех частей работы.

About the authors

Susanna A. Gasparyan

Stavropol State Medical University

Author for correspondence.
Email: prof-gasp55@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8284-8117

MD, PhD, Professor, Chair of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, ul. Mira 310, Stavropol, 355017

Alexandr G. Topuzov

Mineralovodsky Inter-Area Maternity Hospital

Email: topuzov42@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-8613-1548

Chief Physician

Russian Federation, 21 Fevral'skiy per., Mineralnye Vody, 357209

Idilia A. Orfanova

Stavropol State Medical University

Email: idiliya24@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7871-7218

Postgraduate Student, Chair of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, ul. Mira 310, Stavropol, 355017

Sabiiat M. Akhmedova

Stavropol State Medical University

Email: sabiyat.ahmedova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3683-0316

Postgraduate Student, Chair of Obstetrics and Gynecology

Russian Federation, ul. Mira 310, Stavropol, 355017

References

Supplementary files