Сравнение методов модуляционной интерференционной микроскопии, ДНК-спектрометрии, ДНК-цитометрии и проточной цитофлюориметрии при оценке индуцированной фитогемагглютинином активности лимфоцитов крови человека

Актуальность. Исследование структурных особенностей и  функционального состояния клеток иммунной системы и  прежде всего лимфоцитов имеет большое значение как для фундаментальной, так и  для клинической медицины. Необходима разработка простых и надежных методов анализа, позволяющих быстро и  эффективно оценивать активность клеток в реальном времени.

Цель  – оценить эффективность использования метода интерференционной микроскопии в  сравнении с  классическими методами (ДНК-спектрометрия, ДНК-цитометрия и  проточная цитофлюориметрия с  использованием интернализованной флюоресцентной метки CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)) при оценке индуцированной фитогемагглютинином (ФГА) пролиферации лимфоцитов крови человека.

Материал и  методы. ФГА-индуцированную пролиферативную активность лимфоцитов крови 10  здоровых добровольцев оценивали с  использованием различных методических подходов. Бласт-трансформацию лимфоцитов вызывали их инкубацией в  течение 5  суток в присутствии 5 мкг/мл ФГА. Пролиферативную активность клеток оценивали 1) методом ДНКметрии  – в  специализированном планшете Tecan NanoQuant PlateTM путем измерения оптической плотности, на планшет-ридере Infinite 200 Pro; 2) методом цитофотометрии с последующим анализом распределения клеток по содержанию дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) после окраски красителем Фельгена с помощью системы визуализации на базе светового микроскопа Olympus BX41, видеокамеры ProgRes CF; 3) методом проточной цитометрии с  использованием интернализованной флюоресцентной метки CFSE, анализ проводили на проточном цитометре BD FACS Calibur; 4) измерением параметров интерференционного профиля лимфоцитов при помощи модуляционного интерференционного микроскопа МИМ-340 («Швабе», Россия). В  качестве критерия оценки функционального состояния лимфоцитов определяли функциональную активность ядра (англ. functional activity of the nucleus, FAN).

Результаты. Инкубация лимфоцитов с  ФГА приводила к  увеличению линейного размера клеток на 22,2±2,8%  мкм, уменьшению фазовой высоты на 46,3±4,7%  нм ( p=0,019) и  увеличению FAN на 75,9±9,4% по сравнению с контролем (p=0,046). По данным спектроскопии выделенной ДНК, стимуляция лимфоцитов ФГА сопровождалась увеличением количества ДНК на 55% по сравнению с исходным значением (до 409,8±22,3 против 264,3±25,0 нг/мкл, p=0,049). Реакция Фельгена выявила, что в контрольной выборке ядра, содержащие ДНК в  количестве, превышающем 2n, составляют 2%, а в выборке активированных ФГА лимфоцитов – 14,8% с разницей между группами 12,8%. Окраска лимфоцитов CFSE с последующей инкубацией проточной цитофлюориметрией культивированных клеток показала повышение процента пролиферирующих клеток с 1,68±0,9% в контроле до 55,56±5,6%  (p=0,00068) под влиянием митогена.

Заключение. По сравнению с  классическими методами оценки активности лимфоцитов метод модуляционной интерференционной микроскопии не требует пробоподготовки, показывает сопоставимую и  даже большую эффективность, при этом позволяет изучать функциональное состояние лимфоцитов в  реальном времени в динамике культивирования. Это открывает широкие возможности для оценки клеток иммунной системы в исследовательских и диагностических целях.