Rationale: The study of the structural particulars and functional state of immune cells and primarily lymphocytes is of great importance for both fundamental and clinical medicine. It requires the development of simple and reliable analytic methods that would allow for fast and effective real-time assessment of cell activity.
Aim: To evaluate the effectiveness of the interference microscopy compared to DNA spectrometry, DNA cytometry, and flow cytometry with an internalized fluorescent label CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) in the assessment of PHA-induced proliferation of human blood lymphocytes.
Materials and methods: Phytohemagglutinin (PHA)-induced proliferative activity of blood lymphocytes from 10 healthy volunteers was studied with various methodological strategies. Blast transformation of lymphocytes was induced by their incubation for 5 days with PHA 5 μg/mL. The cell proliferative activity was assessed as follows: 1) by DNA spectrometry at 260/280 nm using Tecan Infinite 200 Pro with a specialized NanoQuant Plate™; 2) by cytophotometry followed by cell distribution analysis assessing deoxyribonucleic acid (DNA) content after staining with Felgen's dye with an imaging system based on an Olympus BX41 light microscope with a ProgRes CF camera; 3) by flow cytometry using an internalized fluorescent label CFSE; the analysis was performed with a BD FACS Calibur flow cytometer; 4) by measurement of the lymphocyte interference profile with a modulation interference microscope MIM-340 (Schwabe, Russia). The functional activity of the nucleus (FAN) was determined and used as a criterion for assessment of the lymphocyte functional state.
Results: Incubation of lymphocytes with PHA led to an increase in the linear size by 22.2±2.8%, a decrease in phase height by 46.3±4.7% (p=0.019), and an increase in FAN by 75.9±9.4%, vs control (p=0.046). As measured by isolated DNA spectroscopy, PHA stimulation of lymphocytes was associated with an increase in the amount of DNA by 55% vs baseline (409.8±22.3 ng/μL and 264.3±25.0 ng/μL, respectively, p=0.049). Felgen's reaction revealed that the proportion of nuclei containing more than 2n DNA was 2% in the control cells and 14.8% in the PHA-activated lymphocytes, with a difference between the groups of 12.8%. CFSE staining with subsequent incubation and assessment by flow cytofluorimetry demonstrated an increase in the percentage of proliferating cells from 1.68±0.9% in the control to 55.56±5.6% (p=0.00068) in the mitogen-stimulated sample.
Conclusion: Modulation interference microscopy does not require the sample preparation and demonstrated comparable and even higher effectiveness compared to conventional methods for assessment of lymphocyte activity. At the same time, it allows for evaluation of the lymphocyte functional state in real time in the process of cultivation. This opens ample opportunities for evaluation immune cells for research and diagnostic purposes.
Актуальность. Исследование структурных особенностей и функционального состояния клеток иммунной системы и прежде всего лимфоцитов имеет большое значение как для фундаментальной, так и для клинической медицины. Необходима разработка простых и надежных методов анализа, позволяющих быстро и эффективно оценивать активность клеток в реальном времени.
Цель – оценить эффективность использования метода интерференционной микроскопии в сравнении с классическими методами (ДНК-спектрометрия, ДНК-цитометрия и проточная цитофлюориметрия с использованием интернализованной флюоресцентной метки CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)) при оценке индуцированной фитогемагглютинином (ФГА) пролиферации лимфоцитов крови человека.
Материал и методы. ФГА-индуцированную пролиферативную активность лимфоцитов крови 10 здоровых добровольцев оценивали с использованием различных методических подходов. Бласт-трансформацию лимфоцитов вызывали их инкубацией в течение 5 суток в присутствии 5 мкг/мл ФГА. Пролиферативную активность клеток оценивали 1) методом ДНКметрии – в специализированном планшете Tecan NanoQuant PlateTM путем измерения оптической плотности, на планшет-ридере Infinite 200 Pro; 2) методом цитофотометрии с последующим анализом распределения клеток по содержанию дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) после окраски красителем Фельгена с помощью системы визуализации на базе светового микроскопа Olympus BX41, видеокамеры ProgRes CF; 3) методом проточной цитометрии с использованием интернализованной флюоресцентной метки CFSE, анализ проводили на проточном цитометре BD FACS Calibur; 4) измерением параметров интерференционного профиля лимфоцитов при помощи модуляционного интерференционного микроскопа МИМ-340 («Швабе», Россия). В качестве критерия оценки функционального состояния лимфоцитов определяли функциональную активность ядра (англ. functional activity of the nucleus, FAN).
Результаты. Инкубация лимфоцитов с ФГА приводила к увеличению линейного размера клеток на 22,2±2,8% мкм, уменьшению фазовой высоты на 46,3±4,7% нм ( p=0,019) и увеличению FAN на 75,9±9,4% по сравнению с контролем (p=0,046). По данным спектроскопии выделенной ДНК, стимуляция лимфоцитов ФГА сопровождалась увеличением количества ДНК на 55% по сравнению с исходным значением (до 409,8±22,3 против 264,3±25,0 нг/мкл, p=0,049). Реакция Фельгена выявила, что в контрольной выборке ядра, содержащие ДНК в количестве, превышающем 2n, составляют 2%, а в выборке активированных ФГА лимфоцитов – 14,8% с разницей между группами 12,8%. Окраска лимфоцитов CFSE с последующей инкубацией проточной цитофлюориметрией культивированных клеток показала повышение процента пролиферирующих клеток с 1,68±0,9% в контроле до 55,56±5,6% (p=0,00068) под влиянием митогена.
Заключение. По сравнению с классическими методами оценки активности лимфоцитов метод модуляционной интерференционной микроскопии не требует пробоподготовки, показывает сопоставимую и даже большую эффективность, при этом позволяет изучать функциональное состояние лимфоцитов в реальном времени в динамике культивирования. Это открывает широкие возможности для оценки клеток иммунной системы в исследовательских и диагностических целях.