Эффективность программируемых нуклеаз SpCas9 и AsCpf1 (Cas12a) в геномных локусах safe harbor клеток линии HEK293

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Актуальность. Создание инструментов редактирования генома эукариот на основе программируемых нуклеаз бактерий из систем CRISPR-Cas открывает обширные перспективы для разработки методов генной терапии, клеточных моделей заболеваний человека, а также изучения проявлений патологического фенотипа, наблюдения за клеточными процессами. От точности внесения двуцепочечных разрывов в целевые участки ДНК зависят безопасность и корректность экспериментов как на клеточном, так и организменном уровнях. Поиск новых вариантов более точных нуклеаз CRISPR-Cas и изучения их способности гидролизовать ДНК в составе нуклеосом in vivo представляется актуальной задачей развития технологий геномного редактирования.

Цель – провести анализ активности программируемой нуклеазы AsCpf1 (Cas12a), обладающей низким уровнем нецелевой активности, в локусах генома человека, безопасных для внесения трансгенных конструкций (safe harbor), и сравнить с эффективностью широко применяемой нуклеазы SpCas9 в клетках линии HEK293.

Материал и методы. Выполнен биоинформационный анализ ассоциации целевых районов с нуклеосомами и другими белками в safe harbor локусах AAVS1 и GSH-Ch1 и транскрипционно неактивном гене MYBPC3 кардиального миозинсвязывающего белка 3 в клетках линии HEK293FT на основе данных, полученных методом ATAC-seq базы NCBI SRA для хроматина клеток линии HEK293FT. Проведено создание и внесение плазмидных конструкций, кодирующих нуклеазы SpCas9 и AsCpf1 и направляющих РНК в клетки HEK293FT. Осуществлен анализ событий в целевых районах генома клеток линии HEK293FT методом изучения секвенограмм с помощью алгоритма TIDE.

Результаты. Изучение данных экспериментов ATAC-seq для клеток HEK293FT показало, что локус AAVS1 можно отнести к открытому хроматину с низкой плотностью нуклеосом, а локус GSH-Ch1 – к закрытому хроматину. В клетках HEK293FT ген кардиального белка MyBPc3 имеет промежуточные характеристики хроматина. Проведенное исследование эффективности внесения разрывов в изучаемые локусы хроматина клеток HEK293FT нуклеазами выявило, что SpCas9 справляется с хроматином любой плотности нуклеосом, тогда как AsCpf1 эффективно вносит разрывы в ДНК только в локусах с открытым хроматином – AAVS1 и MYBPC3. В локусе GSH-Ch1 с высокой плотностью нуклеосом события редактирования происходят на очень низком уровне.

Заключение. Показана низкая эффективность нуклеазы AsCpf1 в геномном safe harbor локусе GSH-Ch1, который характеризуется высокой плотностью нуклеосом. При планировании эксперимента по геномному редактированию с помощью нуклеазы AsCpf1 следует учитывать эпигенетический ландшафт хроматина и плотность нуклеосом, а также использовать вещества, влияющие на структуру хроматина.

Об авторах

С. В. Павлова

ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук»

Автор, ответственный за переписку.
Email: sonpavlova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1095-3692

Павлова Софья Викторовна – кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории эпигенетики развития

630090, г. Новосибирск, ул. Мальцева, 1–16

 

Россия

Е. А. Елисафенко

ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук»

Email: antares@bionet.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-3204-8178

Елисафенко Евгений Анатольевич – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории эпигенетики развития

630090, г. Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 10

Россия

Л. Ш. Шаяхметова

ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук»; ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»

Email: fake@neicon.ru

Шаяхметова Лилия Шагитовна – лаборант научно-образовательного отдела ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук»; бакалавр ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»

630090, г. Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 10; 

630090, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 1

Россия

С. П. Медведев

ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук»

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-1520-5549

Медведев Сергей Петрович – кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории эпигенетики развития

630090, г. Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 10

Россия

Список литературы

  1. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, Di-Carlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013;339(6121): 823–826. doi: 10.1126/science.1232033.
  2. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339(6121): 819–823. doi: 10.1126/science.1231143.
  3. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P. CRISPR provides acquired resistance against vi ruses in prokaryotes. Science. 2007;315(5819): 1709–1712. doi: 10.1126/science.1138140.
  4. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Mol Microbiol. 2000;36(1): 244–246. doi: 10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x.
  5. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 2005;60(2): 174–182. doi: 10.1007/s00239-004-0046-3.
  6. Koonin EV, Makarova KS, Zhang F. Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems. Curr Opin Microbiol. 2017;37:67–78. doi: 10.1016/j.mib.2017.05.008.
  7. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096): 816–821. doi: 10.1126/science.1225829.
  8. Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213): 1258096. doi: 10.1126/science.1258096.
  9. Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9): 822–826. doi: 10.1038/nbt.2623.
  10. Kleinstiver BP, Tsai SQ, Prew MS, Nguyen NT, Welch MM, Lopez JM, McCaw ZR, Aryee MJ, Joung JK. Genome-wide specificities of CRIS-PR-Cas Cpf1 nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2016;34(8): 869–874. doi: 10.1038/nbt.3620.
  11. Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRIS-PR-Cas system. Cell. 2015;163(3): 759–771. doi: 10.1016/j.cell.2015.09.038.
  12. Kim D, Kim J, Hur JK, Been KW, Yoon SH, Kim JS. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2016;34(8): 863–868. doi: 10.1038/nbt.3609.
  13. Gao L, Cox DBT, Yan WX, Manteiga JC, Schneider MW, Yamano T, Nishimasu H, Nureki O, Crosetto N, Zhang F. Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities. Nat Biotechnol. 2017;35(8): 789–792. doi: 10.1038/nbt.3900.
  14. Rivière I, Dunbar CE, Sadelain M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 2012;119(5): 1107–1116. doi: 10.1182/blood-2011-09-349993.
  15. Gaspar HB, Cooray S, Gilmour KC, Parsley KL, Zhang F, Adams S, Bjorkegren E, Bayford J, Brown L, Davies EG, Veys P, Fairbanks L, Bordon V, Petropoulou T, Kinnon C, Thrasher AJ. Hematopoietic stem cell gene therapy for adenosine deaminase-deficient severe combined immunodeficiency leads to long-term immunological recovery and metabolic correction. Sci Transl Med. 2011;3(97): 97ra80. doi: 10.1126/scitranslmed.3002716.
  16. Cartier N, Hacein-Bey-Abina S, Bartholomae CC, Veres G, Schmidt M, Kutschera I, Vidaud M, Abel U, Dal-Cortivo L, Caccavelli L, Mahlaoui N, Kiermer V, Mittelstaedt D, Bellesme C, Lahlou N, Lefrère F, Blanche S, Audit M, Payen E, Leboulch P, l'Homme B, Bougnères P, Von Kalle C, Fischer A, Cavazzana-Calvo M, Aubourg P. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 2009;326(5954): 818–823. doi: 10.1126/science.1171242.
  17. Sadelain M, Papapetrou EP, Bushman FD. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nat Rev Cancer. 2011;12(1): 51–58. doi: 10.1038/nrc3179.
  18. Pellenz S, Phelps M, Tang W, Hovde BT, Sinit RB, Fu W, Li H, Chen E, Monnat RJ Jr. New Human Chromosomal Sites with "Safe Harbor" Potential for Targeted Transgene Insertion. Hum Gene Ther. 2019;30(7): 814–828. doi: 10.1089/hum.2018.169.
  19. Horlbeck MA, Witkowsky LB, Guglielmi B, Replogle JM, Gilbert LA, Villalta JE, Torigoe SE, Tjian R, Weissman JS. Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro. Elife. 2016;5:e12677. doi: 10.7554/eLife.12677.
  20. Strohkendl I, Saifuddin FA, Gibson BA, Rosen MK, Russell R, Finkelstein IJ. Inhibition of CRISPR-Cas12a DNA targeting by nucleosomes and chromatin. Sci Adv. 2021;7(11):eabd6030. doi: 10.1126/sciadv.abd6030.
  21. Barkal AA, Srinivasan S, Hashimoto T, Gifford DK, Sherwood RI. Cas9 Functionally Opens Chromatin. PLoS One. 2016;11(3):e0152683. doi: 10.1371/journal.pone.0152683.
  22. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using the CRIS-PR-Cas9 system. Nat Protoc. 2013;8(11): 2281–2308. doi: 10.1038/nprot.2013.143.
  23. Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 2013;10(12): 1213–1218. doi: 10.1038/nmeth.2688.
  24. Kim D, Langmead B, Salzberg SL. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat Methods. 2015;12(4): 357–360. doi: 10.1038/nmeth.3317.
  25. Kearse M, Moir R, Wilson A, Stones-Havas S, Cheung M, Sturrock S, Buxton S, Cooper A, Markowitz S, Duran C, Thierer T, Ashton B, Meintjes P, Drummond A. Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics. 2012;28(12): 1647–1649. doi: 10.1093/bioinformatics/bts199.
  26. Smit AFA, Hubley R, Green P. RepeatMasker Open-4.0. 2013–2015. Available from: http://www.repeatmasker.org.
  27. Ustyantseva EI, Medvedev SP, Vetchinova AS, Minina JM, Illarioshkin SN, Zakian SM. A Platform for Studying Neurodegeneration Mechanisms Using Genetically Encoded Biosensors. Biochemistry (Mosc). 2019;84(3): 299–309. doi: 10.1134/S000629791903012X.
  28. Kimura Y, Shofuda T, Higuchi Y, Nagamori I, Oda M, Nakamori M, Onodera M, Kanematsu D, Yamamoto A, Katsuma A, Suemizu H, Nakano T, Kanemura Y, Mochizuki H. Human Genomic Safe Harbors and the Suicide Gene-Based Safeguard System for iPSC-Based Cell Therapy. Stem Cells Transl Med. 2019;8(7): 627–638. doi: 10.1002/sctm.18-0039.
  29. Schep AN, Buenrostro JD, Denny SK, Schwartz K, Sherlock G, Greenleaf WJ. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Res. 2015;25(11): 1757–1770. doi: 10.1101/gr.192294.115.
  30. Buenrostro JD, Wu B, Chang HY, Greenleaf WJ. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 2015;109:21.29.1–21.29.9. doi: 10.1002/0471142727.mb2129s109.
  31. Boyle AP, Davis S, Shulha HP, Meltzer P, Margulies EH, Weng Z, Furey TS, Crawford GE. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 2008;132(2): 311–322. doi: 10.1016/j.cell.2007.12.014.
  32. Igolkina AA, Zinkevich A, Karandasheva KO, Popov AA, Selifanova MV, Nikolaeva D, Tkachev V, Penzar D, Nikitin DM, Buzdin A. H3K4me3, H3K9ac, H3K27ac, H3K27me3 and H3K9me3 Histone Tags Suggest Distinct Regulatory Evolution of Open and Condensed Chromatin Landmarks. Cells. 2019;8(9): 1034. doi: 10.3390/cells8091034.
  33. Voong LN, Xi L, Wang JP, Wang X. Genome-wide Mapping of the Nucleosome Landscape by Micrococcal Nuclease and Chemical Mapping. Trends Genet. 2017;33(8): 495–507. doi: 10.1016/j.tig.2017.05.007.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Павлова С.В., Елисафенко Е.А., Шаяхметова Л.Ш., Медведев С.П., 2021

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах