Rationale: The development of eukaryote genome engineering tools based on CRISPR-Cas programmable bacterial nucleases systems opens wide horizons for gene therapies, human disease cell modeling, as well as investigation into manifestation of disease phenotypes and visualization of cellular processes. The safety and approximation of experiments both at the cellular and organismal levels depend on the accuracy of introducing double-stranded breaks into the target DNA regions. The search for new variants of more accurate CRISPR-Cas nucleases and evaluation of their ability to hydrolyze nucleosome DNA in vivo is considered a critical task for the development of the genome engineering technologies.
Aim: To analyze the activity of the programmable nuclease AsCpf1 (Cas12a), with low level of off-target activity, in the human genome loci that are safe for the introduction of transgenic constructs (“safe harbor”) and to compare its efficiency with that of the widely used SpCas9 nuclease in HEK293 cells.
Materials and methods: We performed the bioinformatics analysis of the association between target regions with nucleosomes and other proteins in the safe harbor loci AAVS1 and GSH-Ch1 and the transcriptionally inactive gene MYBPC3 (cardiac myosin binding protein 3) based on ATAC-seq data for the HEK293FT cells obtained from the NCBI SRA database. Plasmids encoding SpCas9 and AsCpf1 nucleases and guide RNA to the target regions were constructed and transfected into the HEK293FT cells. Events in the target regions of the HEK293FT cell genome were studied in the sequenograms with the TIDE algorithm.
Results: The results of the ATAC-seq experiments for HEK293FT cells have shown that the AAVS1 locus can be referred as open chromatin with a low nucleosome density, while the GSH-Ch1 locus can be attributed to closed chromatin. In HEK293FT cells, the cardiac MYBPC3 gene has intermediate chromatin density. Assessment of the efficiency of introducing breaks into the studied HEK293FT cell chromatin loci by nucleases has shown that SpCas9 is able to cope with chromatin of any nucleosome density, while AsCpf1 can effectively introduce DNA breaks only at loci with open chromatin, such as AAVS1 and MYBPC3. Editing events occur at a very low rate at the GSH-Ch1 locus with a high nucleosome density.
Conclusion: We have found low efficiency of the AsCpf1 nuclease in the genomic safe harbor locus GSH-Ch1, which is characterized by a high nucleosome density. When planning an experiment on AsCpf1 nuclease genome editing, the epigenetic chromatin landscape and the nucleosome density should be considered, as well as chromatin opening substances should be used.
Актуальность. Создание инструментов редактирования генома эукариот на основе программируемых нуклеаз бактерий из систем CRISPR-Cas открывает обширные перспективы для разработки методов генной терапии, клеточных моделей заболеваний человека, а также изучения проявлений патологического фенотипа, наблюдения за клеточными процессами. От точности внесения двуцепочечных разрывов в целевые участки ДНК зависят безопасность и корректность экспериментов как на клеточном, так и организменном уровнях. Поиск новых вариантов более точных нуклеаз CRISPR-Cas и изучения их способности гидролизовать ДНК в составе нуклеосом in vivo представляется актуальной задачей развития технологий геномного редактирования.
Цель – провести анализ активности программируемой нуклеазы AsCpf1 (Cas12a), обладающей низким уровнем нецелевой активности, в локусах генома человека, безопасных для внесения трансгенных конструкций (safe harbor), и сравнить с эффективностью широко применяемой нуклеазы SpCas9 в клетках линии HEK293.
Материал и методы. Выполнен биоинформационный анализ ассоциации целевых районов с нуклеосомами и другими белками в safe harbor локусах AAVS1 и GSH-Ch1 и транскрипционно неактивном гене MYBPC3 кардиального миозинсвязывающего белка 3 в клетках линии HEK293FT на основе данных, полученных методом ATAC-seq базы NCBI SRA для хроматина клеток линии HEK293FT. Проведено создание и внесение плазмидных конструкций, кодирующих нуклеазы SpCas9 и AsCpf1 и направляющих РНК в клетки HEK293FT. Осуществлен анализ событий в целевых районах генома клеток линии HEK293FT методом изучения секвенограмм с помощью алгоритма TIDE.
Результаты. Изучение данных экспериментов ATAC-seq для клеток HEK293FT показало, что локус AAVS1 можно отнести к открытому хроматину с низкой плотностью нуклеосом, а локус GSH-Ch1 – к закрытому хроматину. В клетках HEK293FT ген кардиального белка MyBPc3 имеет промежуточные характеристики хроматина. Проведенное исследование эффективности внесения разрывов в изучаемые локусы хроматина клеток HEK293FT нуклеазами выявило, что SpCas9 справляется с хроматином любой плотности нуклеосом, тогда как AsCpf1 эффективно вносит разрывы в ДНК только в локусах с открытым хроматином – AAVS1 и MYBPC3. В локусе GSH-Ch1 с высокой плотностью нуклеосом события редактирования происходят на очень низком уровне.
Заключение. Показана низкая эффективность нуклеазы AsCpf1 в геномном safe harbor локусе GSH-Ch1, который характеризуется высокой плотностью нуклеосом. При планировании эксперимента по геномному редактированию с помощью нуклеазы AsCpf1 следует учитывать эпигенетический ландшафт хроматина и плотность нуклеосом, а также использовать вещества, влияющие на структуру хроматина.