Immunohistochemical analysis of PD-L1, CD4, CD8, CD20, and PU.1 expression in a dedifferentiated chondrosarcoma: the clinical and prognostic value

Full Text

Дедифференцированная хондросаркома – редкий пример крайне агрессивного варианта мезенхимальных опухолей костей с установленными и описанными в литературе морфологическими, рентгенологическими и клиническими проявлениями. Этот вариант опухоли встречается с частотой от 1–2 до 10% случаев хондросарком и обычно диагностируется у пациентов старше 50 лет, что отличает его от остеосаркомы, поражающей преимущественно подростков и взрослых до 30 лет [1, 2]. Бифазное строение опухоли, представленное структурами классической хондросаркомы, как правило, низкой или средней степени злокачественности (low grade) в сочетании с резким переходом в высокозлокачественную (high grade) нехрящевую саркому, считается основополагающим признаком данного варианта опухоли [3]. Если классическая хондросаркома демонстрирует относительно медленный рост и ограниченную чувствительность к химио- и радиотерапии, то дедифференцированная форма, наоборот, обладает высокой склонностью к быстрому прогрессированию и метастазированию. Для лечения дедифференцированной саркомы, в отличие от ее классического варианта, часто используется лекарственная терапия, но прогноз заболевания остается крайне неблагоприятным [4].

Дедифференцированная хондросаркома формируется на фоне хондросаркомы низкой степени злокачественности в результате накопления генетических и эпигенетических нарушений, приводящих к потере контроля над клеточной дифференцировкой и пролиферацией, таких как мутации IDH1, IDH2, TP53; инактивация CDKN2A; аберрантная экспрессия MDM2 и CDK4. Эти молекулярные изменения делают дедифференцированную хондросаркому устойчивой ко многим традиционным методам лечения и объясняют ее крайне агрессивное клиническое течение [1, 5, 6]. Несмотря на достижения в области молекулярной онкологии, на сегодняшний день таргетная терапия для опухолей данного типа не разработана. Иммунное микроокружение дедифференцированной хондросаркомы отличается выраженной иммуносупрессией, хроническим воспалением и сниженной активностью противоопухолевого иммунного ответа [7]. К ключевым характеристикам относится преобладание макрофагов опухолевого микроокружения, представленных в основном M2-подтипом, который способствует подавлению иммунного ответа и ремоделированию внеклеточного матрикса. Эти макрофаги секретируют иммуносупрессорные факторы, включая антагонист рецептора интерлейкина-1, интерлейкин-10 и трансформирующий фактор роста β, создавая условия, при которых цитотоксические Т-лимфоциты (CD8⁺) теряют способность эффективно уничтожать опухолевые клетки [8].

Регуляторные Т-клетки (Tregs) также играют важную роль в подавлении иммунного ответа, блокируя активность натуральных киллеров (NK-клеток) и CD8⁺-Т-клеток. Высокая инфильтрация Tregs связана с неблагоприятным прогнозом многих солидных опухолей, поскольку эти клетки способствуют устойчивости опухоли к иммунному ответу, тогда как высокая инфильтрация CD8⁺-клетками ассоциирована с благоприятным прогнозом [9, 10]. Дополнительно опухолевые клетки активно экспрессируют PD-L1, что позволяет им избегать атаки со стороны Т-клеток, подавляя их пролиферацию и активность [11]. В совокупности эти факторы создают условия, при которых дедифференцированная хондросаркома практически не поддается иммунотерапии ингибиторами контрольных точек (анти-PD-1, анти-CTLA-4), а противоопухолевый иммунный ответ остается недостаточным для борьбы с прогрессией заболевания. Имеются единичные данные о том, что некоторые методы иммунотерапии, такие как применение провоспалительных цитокинов, онколитических вакцин и адаптивный перенос активированных Т-клеток, показали эффективность в лечении пациентов с саркомами костей и мягких тканей, но не в случае дедифференцированной хондросаркомы [12, 13]. В связи с этим целью данной работы был анализ экспрессии маркеров воспалительного инфильтрата опухолевой стромы PD-L1, CD4, CD8, CD20 и PU.1 в образцах первичных опухолей дедифференцированной хондросаркомы для поиска новых мишеней прогноза и терапии, а также потенциальных предикторов ее эффективности.

Материал и методы

Ретроспективно проанализированы образцы первичных опухолей дедифференцированной хондросаркомы, полученные от 42 пациентов (18 мужчин и 24 женщин в возрасте от 24 до 94 лет; медиана – 65 лет), проходивших обследование и лечение в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России в период с 2012 по 2023 г. Проведение исследования одобрено этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (протокол от 02.09.2021). Клинические данные, включая возраст, пол, гистологический подтип дедифференцированного компонента опухоли, стадию заболевания, дифференцировку опухоли, были собраны из медицинских карт пациентов. Критерии включения в исследование: гистологически подтвержденный диагноз, наличие доступных архивных гистологических образцов, полные клинические данные. Критерии исключения: неполные данные наблюдения, неоадъювантная химиотерапия, наличие сопутствующих злокачественных новообразований.

Иммуногистохимический (ИГХ) анализ проводили в автоматизированном ИГХ-стейнере Ventana BenchMark ULTRA (Ventana Medical Systems, США) с применением оптимизированного протокола и антител анти-PD-L1 (клон SP142, Ventana Medical Systems, США) и в ручном режиме для окраски с использованием антител к PU.1 (клон 9G7, Cell Signaling Technology, США), CD4, CD8 (клон C8/144B, Dako, США) и CD20 (клон RM272, Sigma-Aldrich, США). Клетки-мишени обнаруживали с помощью универсальной системы детекции OptiView DAB IHC Detection Kit (Ventana Medical Systems, США) согласно инструкции производителя. Для контроля протокола ИГХ-исследования при окрашивании на PD-L1 использовали внутрилабораторные тканевые позитивные контроли (ткани миндалины, плаценты, немелкоклеточного рака легкого).

Оценку окрашивания проводили при помощи микроскопа Olympus BX53F (Olympus, Япония) путем определения процентного содержания исследуемых клеточных популяций. В случае PD-L1 оценку экспрессии выполняли отдельно в дедифференцированном и хондроидном компонентах клеток опухоли. Особо учитывали образцы, содержащие PD-L1-экспрессирующие лимфоциты. Все образцы были разделены на 2 группы в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии PD-L1.

Полученные данные обрабатывали с помощью программы GraphPad Prizm 10.0. Для выбора критерия оценки статистической значимости отличия выборок проведена оценка нормальности распределения с помощью критерия Д’Агостино. При сравнении показателей и анализе их взаимосвязей использовали t-критерий Стьюдента. Корреляционный анализ проводили с помощью определения коэффициента корреляции Пирсона. Анализ таблиц сопряженности осуществляли с использованием точного критерия Фишера и критерия χ². Для анализа выживаемости группы были сформированы относительно содержания PD-L1 в опухолевых клетках (наличие или отсутствие экспрессии) или среднего процентного содержания иммунных клеток микроокружения. Анализ выживаемости проводили с помощью построения кривых дожития по методу Каплана – Майера. Период наблюдения составил временной интервал с момента операции до смерти пациента или его последнего посещения врача. Сравнение статистической значимости различий выполняли при использовании логарифмического рангового критерия. Различия и корреляции считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Микроскопическое исследование показало, что дедифференцированная опухоль состояла из 2 компонентов: высокодифференцированной хондросаркомы и низкодифференцированной нехрящевой саркомы. Наиболее часто диагностирована плеоморфная недифференцированная саркома – в 33 случаях, остеосаркома выявлена в 6 случаях, рабдомиосаркома – в 2 и ангиосаркома – в 1 наблюдении. Описание клинико-морфологических характеристик приведено в табл. 1.

 

Таблица 1. Характеристика пациентов с дедифференцированной хондросаркомой

Характеристика	Число наблюдений, абс.
Пол пациента:
мужской	18
женский	24
Дифференцировка опухоли:
G1	22
G1–2	15
G3	5
Стадия заболевания:
II	21
III–IV	21
Дедифференцированный компонент при диагнозе:
установлен	16
не установлен	26

 

Анализ экспрессии PD-L1 в образцах дедифференцированной хондросаркомы выявил следующие закономерности. Экспрессия PD-L1 в дедифференцированном компоненте опухоли наблюдалась в 40% (17 из 42) случаев, в хондроидном компоненте – в 26% (11 из 42), в обоих компонентах опухоли – в 17% (7 из 42) случаев. Пример иммуногистохимического окрашивания на PD-L1 представлен на рис. 1.

 

Рис. 1. Иммуногистохимический метод исследования. Положительная ядерно-цитоплазматическая экспрессия маркера PD-L1 в опухолевых клетках и опухоль-инфильтрирующих лимфоцитах в полиморфноклеточном саркоматозном образце дедифференцированной хондросаркомы (стрелки). Микропрепарат (×200)

 

Анализ клинической значимости экспрессии PD-L1 показал, что ни один из изученных факторов (возраст, пол, гистологический подтип опухоли, степень дифференцировки, стадия заболевания и наличие дедифференцированного компонента опухоли на момент диагностики) не ассоциирован с экспрессией PD-L1 в дедифференцированном компоненте, хондроидном компоненте или в обоих компонентах дедифференцированной хондросаркомы (табл. 2).

 

Таблица 2. Ассоциация экспрессии PD-L1 с клинико-морфологическими характеристиками больных дедифференцированной хондросаркомой

Характеристика, абс.*	Дедифференцированный компонент опухоли			Хондроидный компонент опухоли			Оба компонента в одном образце
	PD-L1 +	PD-L1 -	p	PD-L1 +	PD-L1 -	p	PD-L1 +	PD-L1 -	p
Возраст:
< 65 лет	6	17	0,058	5	18	0,504	2	21	0,214
> 65 лет	11	8		6	13		5	14
Пол:
мужской	7	11	> 0,999	5	13	> 0,999	3	15	> 0,999
женский	10	14		6	18		4	20
Гистологический тип:
недифференцированная саркома	13	20	0,639	8	25	0,409	5	28	0,603
остеосаркома	2	4		3	3		2	4
рабдомиосаркома	1	1		0	2		0	2
ангиосаркома	1	0		0	1		0	1
Дифференцировка опухоли:
G1	9	13	0,574	5	17	0,729	5	17	0,427
G1–2	7	8		4	11		2	13
G3	1	4		2	3		0	5
Стадия заболевания:
II	7	14	0,530	5	16	> 0,999	2	19	0,409
III–IV	10	11		6	15		5	16
Дедифференцированный компонент при установлении диагноза:
да	6	10	> 0,999	7	9	0,070	3	13	> 0,999
нет	11	15		4	22		4	22

PD-L1 + – наличие экспрессии PD-L1, PD-L1 - – отсутствие экспрессии PD-L1

^* Количество наблюдений

 

Экспрессия PD-L1 в опухолевых клетках, особенно в случае ее выявления в дедифференцированном компоненте опухоли, имела тенденцию к неблагоприятному прогнозу (отношение риска 3,150; p = 0,096) (табл. 3).

 

Таблица 3. Статистический анализ прогностической значимости PD-L1 при дедифференцированной хондросаркоме

Высокая / низкая экспрессия PD-L1	Однофакторный анализ
	ОР	95% ДИ	p
Дедифференцированный компонент	3,150	0,6230–15,93	0,096
Хондроидный компонент	1,503	0,2440–9,262	0,6143
Оба компонента в одном образце	3,122	0,3023–32,25	0,1365

ДИ – доверительный интервал, ОР – oтношение риска

 

В группе больных дедифференцированной хондросаркомой c отсутствием экспрессии PD-L1 медиана выживаемости составила 68,6 месяца, а в группе с наличием экспрессии данного маркера – 7,7 месяца (рис. 2).

 

Рис. 2. Анализ прогностической значимости экспрессии PD-L1 в различных компонентах дедифференцированной хондросаркомы: общая выживаемость пациентов в зависимости от экспрессии PD-L1 в дедифференцированном (А), хондроидном (Б) и в обоих (В) компонентах опухоли. PD-L1 - – отсутствие экспрессии PD-L1, PD-L1 + – наличие экспрессии PD-L1

 

Проведен ИГХ-анализ фенотипа клеток воспалительного инфильтрата дедифференцированного компонента исследуемых опухолей. Для выявления макрофагов в опухолевой строме использовали пан-макрофагальный маркер PU.1, для выявления Т-клеток – CD4 и CD8, а для B-клеток – CD20 (рис. 3).

 

Рис. 3. Иммуногистохимический метод исследования. Экспрессия маркеров PU.1 (А), CD20 (Б), СD4 (В) и СD8 (Г) в опухоль-инфильтрирующих лимфоцитах в образцах ткани дедифференцированной хондросаркомы (стрелки). Микропрепарат (×100)

 

Доминирующей популяцией иммунных клеток в строме дедифференцированной хондросаркомы были макрофаги. Среднее содержание макрофагов в дедифференцированном компоненте опухоли составило 17,3 ± 12,8%, CD4⁺-Т-клеток – 4 ± 3,5%, CD8⁺-Т-клеток – 4 ± 2,4%, В-клеток – 6,7 ± 3,8%.

Обнаружена значимая ассоциация между содержанием CD20⁺-клеток в опухоли и стадией заболевания, а именно: более высокая инфильтрация опухоли В-клетками характерна для более ранней стадии заболевания (p = 0,045). Установлено также, что при идентификации дедифференцированного компонента опухоли на этапе установления диагноза для данного типа опухолей наблюдалась более высокая значимая инфильтрация макрофагами и В-клетками (p = 0,003 и p = 0,017 соответственно) (табл. 4). Вместе с тем прогностической значимости исследованных маркеров не выявлено (рис. 4). Однако стоит отметить, что высокая макрофагальная инфильтрация опухолей дедифференцированной хондросаркомы имеет тенденцию к неблагоприятному прогнозу течения заболевания, а медиана выживаемости пациентов отличается вдвое (30,5 месяца против 68,6 месяца) (отношение риска 3,205; p = 0,112).

 

Таблица 4. Ассоциация содержания иммунных клеток PU.1⁺, CD4⁺, CD8⁺ и CD20⁺ у пациентов с дедифференцированной хондросаркомой с учетом клинико-морфологических характеристик

Характеристика	PU.1		CD4		CD8		CD20
	M ± SD, %	p	M ± SD, %	p	M ± SD, %	p	M ± SD, %	p
Возраст:
< 65 лет	16,8 ± 12,2	0,790	3,7 ± 3,7	0,642	4,4 ± 2,7	0,451	6,6 ± 4,3	0,764
> 65 лет	17,9 ± 1 3,9		4,3 ± 3,3		3,7 ± 2,1		7,0 ± 3,4
Пол:
мужской	21,1 ± 11,2	0,086	5,3 ± 3,2	0,059	4,1 ± 2,2	0,991	7,6 ± 4,1	0,274
женский	14,1 ± 13,5		3,1 ± 3,5		4,1 ± 2,7		6,1 ± 3,5
Гистологический тип дедифференцированного компонента:
недифференцированная саркома	18,9 ± 13,2	0,411	4,1 ± 3,4	0,893	3,87 ± 2,2		6,8 ± 4,0	0,643
остеосаркома	11,0 ± 8,9		3,0 ± 4,4		3,75 ± 2,5		7,5 ± 2,8
рабдомиосаркома	5*		5,0 ± 7,1		10*		7,5 ± 3,5
ангиосаркома	10*		5*		–		2*
Дифференцировка опухоли:
G1	15,0 ± 12,7	0,451	3,7 ± 3,4	0,740	3,3 ± 2,1	0,110	6,5 ± 4,2	0,877
G1–2	20,7 ± 13,1		4,2 ± 3,8		5,3 ± 2,4		7,3 ± 3,7
G3	18,0 ± 13,0		5,0 ± 3,5		3,3 ± 2,8		6,6 ± 2,8
Стадия:
II	18,4 ± 12,1	0,603	4,9 ± 3,4	0,138	3,7 ± 2,7	0,443	8,0 ± 4,2	0,045
III–IV	16,2 ± 13,6		3,2 ± 3,6		4,4 ± 2,1		5,3 ± 2,7
Дедифференцированный компонент при установлении диагноза:
да	24,6 ± 9,9	0,003	5,3 ± 3,4	0,069	4,1 ± 2,2	0,852	9,0 ± 4,4	0,017
нет	12,7 ± 12,4		3,2 ± 3,5		4,0 ± 2,6		5,7 ± 3,1

Данные представлены в виде среднего процентного содержания клеток и стандартного отклонения (M ± SD, %)

^* Абсолютные значения

 

Рис. 4. Общая выживаемость пациентов с дедифференцированной хондросаркомой в зависимости от содержания макрофагов (А – PU.1), B-клеток (Б – CD20) и Т-клеток различных фенотипов (В – CD4, Г – CD8) в строме дедифференцированного компонента опухолей. Для анализа выживаемости группы сравнения были сформированы в зависимости от содержания иммунных клеток микроокружения выше или ниже среднего

 

Корреляционный анализ между экспрессией PD-L1 и инфильтрацией стромы опухоли иммунными клетками показал, что количество PU.1⁺-клеток в строме опухоли прямо положительно коррелирует с экспрессией PD-L1 как в хондроидном, так и в дедифференцированном компонентах опухоли (r = 0,357, p = 0,028; r = 0,343, p = 0,033 соответственно), а также с содержанием Т-клеток (r = 0,402, p = 0,014).

Обсуждение

Настоящее исследование посвящено изучению опухолевого микроокружения дедифференцированной хондросаркомы – редкой мезенхимальной опухоли с неблагоприятным прогнозом и ограниченными возможностями терапии. С учетом активного внедрения иммунотерапии в лечение солидных опухолей исследователи уделяют особое внимание анализу клеточного состава иммунного инфильтрата, поскольку он во многом определяет эффективность терапии [14]. Мы выявили экспрессию PD-L1 в дедифференцированном компоненте хондросаркомы в 40% наблюдений, а в хондроидном компоненте – в 26%, что соответствует данным литературы. Так, в исследовании M. Kostine и соавт. экспрессия PD-L1 наблюдалась в 52% образцов дедифференцированной хондросаркомы и коррелировала с инфильтрацией опухоли Т-клетками [7]. R. Iseulys и соавт. проанализировали выборку из 49 пациентов с дедифференцированной хондросаркомой и обнаружили экспрессию PD-L1 в 43% опухолевых клеток [10].

Нами установлено отсутствие ассоциации между экспрессией PD-L1 в различных компонентах дедифференцированной хондросаркомы и основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания. Анализ прогностической значимости PD-L1 показал, что экспрессия данного белка в опухолевых клетках в дедифференцированном компоненте опухоли имеет тенденцию к неблагоприятному прогнозу заболевания. Полученные нами результаты согласуются с данными исследования Y. Zhang и соавт., в котором экспрессия PD-L1 в опухолевых клетках хондросарком была ассоциирована с неблагоприятным прогнозом [11]. Вместе с тем аналогичные исследования, проведенные R. Iseulys и соавт., свидетельствуют о том, что экспрессия PD-L1 в опухолевых клетках не всегда может служить надежным предиктором течения заболевания [10].

R. Iseulys и соавт. выдвинули гипотезу о возможной роли экспрессии PD-L1 в стромальных клетках дедифференцированной хондросаркомы как потенциального благоприятного прогностического маркера. Авторы выявили 3 образца, в которых отмечалась экспрессия PD-L1 в лимфоцитах стромы. Все пациенты с такими опухолевыми характеристиками оставались живы на момент проведения исследования. Однако, учитывая малое число наблюдений, данное предположение должно быть проверено на более объемной выборке [10]. В целом опубликованы единичные исследования, посвященные клинической значимости иммунных клеток в развитии дедифференцированной хондросаркомы [15]. Мы подтвердили данные литературы, согласно которым доминирующая популяция иммунных клеток опухолевой стромы – макрофаги [10]. Наибольшее число макрофагов в дедифференцированном компоненте опухоли выявлено в том случае, когда дедифференцированный компонент представлен недифференцированной саркомой. Отметим также, что высокая макрофагальная инфильтрация дедифференцированной хондросаркомы имела тенденцию к неблагоприятному течению заболевания, что характерно для большинства солидных опухолей [16]. В нашем исследовании содержание макрофагов в строме опухоли прямо положительно коррелировало с экспрессией PD-L1 как в хондроидном, так и в дедифференцированном компонентах опухоли, а также с содержанием Т-клеток, что может указывать на иммуногенность данных опухолей и их потенциальную чувствительность к ингибиторам контрольных точек.

К ограничениям нашего исследования следует отнести небольшой размер выборки, ретроспективный характер работы и отсутствие информации о проводимой в дальнейшем терапии и ее эффективности.

Заключение

Проведенное нами исследование показало, что экспрессия PD-L1 в опухолевых клетках дедифференцированной хондросаркомы, особенно в дедифференцированном компоненте, ассоциирована с неблагоприятным прогнозом и снижением выживаемости пациентов. Анализ иммунного микроокружения выявил различное содержание макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, при этом высокая инфильтрация макрофагами может указывать на агрессивное течение опухоли. Корреляция между уровнем PU.1⁺-клеток, экспрессией PD-L1 и инфильтрацией Т-клетками свидетельствует о сложных механизмах взаимодействия опухоли с иммунной системой. Полученные данные подчеркивают значимость экспрессии PD-L1 и макрофагальной инфильтрации в развитии дедифференцированной хондросаркомы и необходимость дальнейших исследований их роли в прогнозе и терапии заболевания.

Дополнительная информация

Финансирование

Работа проведена без привлечения дополнительного финансирования со стороны третьих лиц.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов

Н.Е. Кушлинский – концепция исследования, утверждение итогового варианта рукописи; О.В. Ковалева, А.Н. Грачев – анализ полученных данных, написание текста; И.В. Булычева, Д.В. Рогожин – сбор клинического материала, гистологическое исследование опухолей, редактирование рукописи; П.Л. Прищеп – анализ историй болезни и данных литературы. Все авторы прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией, согласны нести ответственность за все аспекты работы и гарантируют, что ими надлежащим образом были рассмотрены и решены вопросы, связанные с точностью и добросовестностью всех частей работы.

About the authors

Olga V. Kovaleva

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: ovkovaleva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6132-9924

Doctor of Biol. Sci., Senior Research Fellow, Laboratory of Regulation of Cellular and Viral Oncogenes

Россия, Kashirskoe shosse 24, Moscow, 115522

Irena V. Boulytcheva

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Author for correspondence.
Email: irena@boulytcheva.com
ORCID iD: 0000-0001-7592-4249

MD, PhD, Pathologist, Pathological Anatomy Department

Россия, Kashirskoe shosse 24, Moscow, 115522

Dmitrii V. Rogozhin

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: pathol.777@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0777-9152

MD, PhD, Head of Department of Morphological and Molecular Genetic Diagnostics of Tumors

Россия, Kashirskoe shosse 24, Moscow, 115522

Alexei N. Gratchev

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: alexei.gratchev@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2137-1866

Doctor of Biol. Sci., Head of Laboratory of Tumor Stromal Cell Biology

Россия, Kashirskoe shosse 24, Moscow, 115522

Polina L. Prishchep

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: paulig92@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0810-8238

Postgraduate Student, Pediatric Oncologist, Pediatric Oncology Department No. 2 (Chemotherapy of Tumors of the Musculoskeletal System), Research Institute of Pediatric Oncology and Hematology named after Academician of Russ. Acad. Med. Sci. L.A. Durnov

Россия, Kashirskoe shosse 24, Moscow, 115522

Nikolay E. Kushlinskii

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: biochimia@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3898-4127

MD, PhD, Professor, Member of Russ. Acad. Sci., Scientific Director of the Clinical Diagnostic Laboratory, Consultative and Diagnostic Center1; ORCID: https://orcid.org/. E-mail: 

Россия, Kashirskoe shosse 24, Moscow, 115522

References

Supplementary files