Детекция кольцевых РНК hsa_circ_0031263, hsa_circ_0072715 и hsa_circ_0136666, ассоциированных с колоректальным раком, в плазме крови с помощью нанопроводных чипов

Полный текст

Колоректальный рак (КРР) – одно из наиболее распространенных онкологических заболеваний с высокой смертностью, характеризующееся устойчивой тенденцией дебюта в возрастной группе младше 50 лет [1, 2]. Согласно мировой статистике, КРР занимает 3–4-е место в структуре заболеваемости онкопатологией в Европе, Китае и Северной Америке [3] и вышел на 2-е место среди причин смерти от онкологических заболеваний [4].

Сегодня «золотым стандартом» в диагностике КРР признана оптическая (эндоскопическая) колоноскопия, играющая центральную роль в программах скрининга пациентов. Этот метод позволяет выявлять не только злокачественные образования в прямой кишке, но и предраковые изменения, такие как аденоматозные полипы и зубчатые аденомы [5, 6]. Вместе с тем метод имеет существенное ограничение – необходимость предварительной подготовки (очищения кишечника), что часто связано с использованием медикаментозных препаратов (слабительных) и дополнительных процедур (клизм) [7]. Негативная реакция на предварительную подготовку может служить причиной отказа пациента от процедуры колоноскопии [6]. Важно отметить, что эндоскопическая колоноскопия – инвазивный метод [8, 9], болезненный для пациента [9]. Ирригоскопия, популярный в медицинской практике и альтернативный колоноскопии метод, также относится к инвазивным [8], при этом его чувствительность относительно колоноскопии значительно ниже [7].

Указанные обстоятельства определяют необходимость разработки и внедрения в клиническую практику неинвазивных методов диагностики заболеваний прямой кишки [9]. Перспективным подходом считают жидкую биопсию, принцип которой заключается в детекции циркулирующих в крови пациента ДНК опухолевых клеток и других нуклеиновых кислот (микроРНК и длинных некодирующих РНК), ассоциированных с развитием онкологического заболевания [10]. МикроРНК как маркеры могут быть неспецифичными к конкретным онкологическим заболеваниям [11]. Кольцевые (циркулярные) РНК (кольцРНК), напротив, обладают потенциалом в плане использования в качестве маркеров онкологических заболеваний, так как по сравнению с микроРНК их замкнутая структура более стабильна и они имеют более высокую клеточную и тканевую специфичность [12, 13].

КольцРНК – уникальный класс биологически активных молекул РНК, пространственная структура которых представляет собой замкнутую петлю [14, 15]. Установлено, что кольцРНК образуются посредством обратного сплайсинга линейных РНК с формированием ковалентной связи [14, 15]; кольцРНК экспрессируются в тканях [16], но при этом широко представлены (циркулируют) в крови [17, 18] и обнаруживаются в плазме крови [18]. В отличие от линейных РНК, кольцРНК не имеют 5´- и 3´-концов и, соответственно, более химически стойки (в частности, устойчивы к воздействию экзонуклеаз) [15], что определяет их преимущество в качестве маркеров. К основным функциям кольцРНК относят контроль линейного сплайсинга РНК и участие в экспрессии генов [19, 20]. При развитии рака экспрессия кольцРНК нарушается за счет различных механизмов, таких как амплификация или делеция генов кольцРНК, аномальный контроль транскрипции кольцРНК, дефекты в механизме биогенеза кольцРНК [21]. Уровень кольц- РНК в опухолевой ткани (и, соответственно, концентрация в крови) по сравнению со здоровой может быть как пониженным [22, 23], так и повышенным [24]. Как следствие, изменение уровня конкретной маркерной кольцРНК в ткани (и, соответственно, в плазме крови) может свидетельствовать о наличии заболевания.

J.N. Guo и соавт. показали, что при КРР уровень экспрессии кольцРНК hsa_circ_0000069 повышен и связан с пролиферацией, миграцией и инвазией опухолевых клеток [25]. X. Zhang и соавт. установили роль hsa_circ_0020397 в патогенезе КРР, выявив свойство этой кольцРНК регулировать жизнеспособность клеток при КРР, их апоптоз и инвазию [26]. S. Chen и соавт. идентифицировали 10 245 дифференциально экспрессируемых кольцРНК (6264 с повышенной регуляцией и 3981 с пониженной), уровень трех из них повышался при КРР: hsa_circ_0136666_CBC1, hsa_circ_0031263_CBC1 и hsa_circ_0072715_CBC1 [16]. Таким образом, появилась возможность практического применения кольцРНК, в частности hsa_circ_0136666_CBC1, hsa_circ_0031263_CBC1 и hsa_circ_0072715_CBC1, в качестве биомаркеров в неинвазивных методах диагностики КРР. При этом ключевым аспектом следует признать чувствительность метода детекции маркеров КРР.

Среди наиболее чувствительных неинвазивных методов детекции РНК-маркеров онкологических заболеваний выделяется биосенсорный метод с использованием чипов с чувствительными (сенсорными) элементами нанометрового размера (нанопроводами, НП) [27–33]. Высокую чувствительность этого метода обеспечивает именно малый размер НП [34]. Для детекции РНК-маркеров используют ДНК-зонды (англ. DNA probe) – фрагменты ДНК, которые применяют для гибридизации с комплементарными участками РНК и, следовательно, для идентификации таких молекул. В этом методе на поверхности НП-чипа иммобилизуют олигонуклеотидные ДНК-зонды (оДНК-зонды), комплементарные детектируемым молекулам РНК. Комплементарность оДНК-зондов целевым молекулам РНК обеспечивает их биоспецифическое связывание с поверхностью НП-чипа. В результате образованной связи изменяется физическая характеристика (электрическая проводимость) НП. Это изменение и регистрируют в процессе анализа исследуемого образца на предмет содержания в нем целевой РНК [27–33].

Цели настоящей работы – определение нижнего предела концентрационной чувствительности детекции кольцРНК (hsa_circ_0136666_CBC1, hsa_circ_0031263_CBC1 и hsa_circ_0072715_CBC1), ассоциированных с развитием КРР, при помощи НП-чипов с иммобилизованными оДНК-зондами; демонстрация применимости этих чипов для неинвазивной детекции кольцРНК в плазме крови с целью диагностики КРР; определение возможности использования НП-чипов для выявления ранних стадий КРР.

Материал и методы

Дизайн исследования

Проведено экспериментальное одномоментное выборочное исследование применимости НП-чипов с иммобилизованными оДНК для детекции целевых кольцРНК hsa_circ_0136666_CBC1, hsa_circ_0031263_CBC1 и hsa_circ_0072715_CBC1, ассоциированных с развитием КРР. Дизайн исследования предусматривал сбор образцов биологического материала (крови) от пациентов с КРР и пациентов без онкопатологии, подготовку образцов (в том числе выделение РНК из образцов плазмы крови) и проведение измерений для выявления в исследуемых образцах целевых кольцРНК (hsa_circ_0136666_CBC1, hsa_circ_0031263_CBC1 и hsa_circ_0072715_CBC1). Исследование включало в себя подготовительный и два основных этапа.

На подготовительном этапе проводили иммобилизацию оДНК-зондов, комплементарных целевым кольцРНК, на поверхности чувствительных элементов НП-чипов и проверку эффективности иммобилизации оДНК-зондов.

На I основном этапе определяли нижний концентрационный предел обнаружения целевых молекул нуклеиновых кислот с использованием НП-чипов с иммобилизованными оДНК, комплементарными целевым молекулам. Для этого проводили измерения с использованием НП-чипов и очищенных буферных растворов с известной концентрацией модельных оДНК, нуклеотидные последовательности которых соответствовали таковым целевых кольцРНК: hsa_circ_0136666_CBC1, hsa_circ_0031263_CBC1 и hsa_circ_0072715_CBC1.

На II основном этапе исследовали применимость НП-чипов с иммобилизованными оДНК для детекции трех целевых кольцРНК в образцах РНК, выделенных из плазмы крови больных КРР. В качестве контрольных использовали образцы РНК, выделенные из плазмы крови пациентов без онкопатологии.

Образцы биоматериала и их подготовка для исследования

Образцы плазмы крови принадлежали больным с подтвержденным диагнозом КРР, контрольные – пациентам без онкологических заболеваний. В табл. 1 обобщена основная информация о пациентах. Все образцы были взяты из Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н.Н. Блохина и Института урологии и репродуктивного здоровья человека Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовского Университета).

 

Таблица 1. Информация об исследуемых и контрольных образцах плазмы крови

Образцы (№)	Возраст пациента, годы	Пол	Стадия TNM
Колоректальный рак:
К193	65	м	T3N0M0 (IIa)
К114	67	м	T4N0M0 (IIb)
К10	65	м	T3N0M0 (IIa)
13	54	ж	T2N0M0 (I)
17	51	м	T2N0M0 (I)
26	63	ж	T3N0M0 (IIa)
Контроль (без онкопатологии):
26р	55	ж	T0N0M0
12р	40	ж	T0N0M0

TNM – система стадирования рака, предложенная Американским объединенным комитетом по изучению рака (American Joint Committee on Cancer, AJCC); ж – женщина; м – мужчина

 

Забор крови пациентов проводили из локтевой вены натощак во время медицинского обследования. Образцы крови помещали в контейнеры, содержащие антикоагулянт – 3,8% цитрат натрия (S-Monovette, SARSTEDT, ФРГ), и центрифугировали при комнатной температуре и 3000 об/мин в течение 6 мин. Полученные таким образом образцы плазмы крови хранили в замороженном состоянии при (-80) °C до их использования в экспериментах.

Выделение суммарной РНК, включая кольц-РНК, из образцов плазмы крови проводили по соответствующему протоколу производителя набора ExtractRNA (Евроген, Россия).

Подготовка нанопроводных чипов для исследования

Метод нанопроводной детекции с использованием кремниевых НП-чипов был разработан нами ранее [35, 36]. Технология изготовления чипов подробно изложена в работах [31, 32, 37]. Физический принцип детекции нуклеиновых кислот при помощи таких НП-чипов и используемая для этого аппаратура детально описаны в наших предыдущих публикациях [30–33, 37, 38]. Фотоизображение поверхности НП-чипа представлено на рис. 1. На поверхности одного такого чипа имеется 10 отдельных чувствительных НП.

 

Рис. 1. Поверхность нанопроводного чипа. На выноске показано увеличенное оптическое изображение чувствительного элемента чипа (нанопровода)

 

Для использования НП-чипов в экспериментах по детекции нуклеиновых кислот на поверхности чувствительных элементов иммобилизовали оДНК-зонды по процедуре, описанной в наших работах [30–33, 37, 38]. Поверхность НП-чипа предварительно силанизировали в парах 3-аминопропилтриэтоксисилана для обеспечения иммобилизации оДНК-зондов и затем непосредственно иммобилизовали оДНК-зонды на силанизированной поверхности отдельных чувствительных элементов НП-чипа. Эффективность процедур силанизации поверхности НП-чипа и иммобилизации оДНК-зондов на этой поверхности контролировали по сдвигу вольт-амперных характеристик (ВАХ) НП [30–33, 37, 38].

Типичные кривые ВАХ, полученные в экспериментах, приведены на рис. 2: мы наблюдали смещение ВАХ в сторону более высоких значений напряжения на затворе (V_g) как после силанизации НП-чипа, так и после иммобилизации оДНК-зондов на поверхности НП (между его контактами). Данный факт подтверждает эффективность иммобилизации оДНК-зондов и позволяет использовать НП-чип в экспериментах по детекции целевых кольцРНК.

 

Рис. 2. Оценка эффективности силанизации нанопроводного чипа и иммобилизации ДНК-олигонуклеотидных зондов (оДНК-зондов) на поверхности чувствительного элемента чипа (нанопровода, НП) путем измерения вольт-амперных характеристик (ВАХ) НП-1; I_ds (отн. ед.) – сила тока/сигнала между контактами НП-1 (сток – исток); V_g (В) – постоянное напряжение на затворе. Экспериментальные условия: 1 мМ калий-фосфатный буферный раствор (pH = 7,4), напряжение на затворе V_g от 0 до 50 В, напряжение между контактами НП (напряжение «сток – исток») V_ds = 0,1 В

 

Иммобилизованные на поверхности чувствительных элементов НП-чипа оДНК-зонды были приобретены в ЗАО «Евроген» (Москва, Россия). Характеристики оДНК-зондов (их нуклеотидные последовательности и комплементарные им целевые кольцРНК), иммобилизованных на поверхности НП и обозначенных как probe_1 (зонд_1), probe_2 (зонд_2), probe_3 (зонд_3), приведены в табл. 2. Для обеспечения иммобилизации на поверхность НП оДНК-зонды имели на 5´-конце дополнительно введенную аминогруппу [30–33, 37, 38].

 

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных ДНК-зондов, ковалентно иммобилизованных на поверхности чипов с нанопроводами

Наименование оДНК-зонда	Нуклеотидная последовательность оДНК-зонда	Комплементарная целевая кольцРНК
probe_1	(NH2)-TTTTTTTTTTAGGACTTCCCCATTG	hsa_circ_0031263 [16]
probe_2	(NH2)-TTTTTTTTTTTTAAAAGCCATTTCC	hsa_circ_0072715 [16]
probe_3	(NH2)-TTTTTTTTTTGTAGCTCTGCACCCA	hsa_circ_0136666 [16]

ДНК-зонд – фрагмент ДНК, комплементарный участкам целевых биомолекул; кольцРНК – кольцевая РНК; оДНК – олигонуклеотид ДНК

 

Определение нижнего концентрационного предела обнаружения целевых кольцевых РНК при помощи модельных олигонуклеотидов ДНК

В экспериментах по определению предела обнаружения целевых кольцРНК мы использовали их аналоги – синтетические модельные оДНК, нуклеотидные последовательности которых комплементарны как оДНК-зондам, так и целевым кольцРНК, ассоциированным с развитием КРР. Последовательности модельных оДНК, определенные при помощи ресурса circBank (http://www.circbank.cn/), приведены в табл. 3.

 

Таблица 3. Используемые модельные олигонуклеотиды ДНК с последовательностями, соответствующими целевым участкам кольцевой РНК и комплементарными оДНК-зонду

Модельный оДНК	Последовательность модельного оДНК, комплементарная оДНК-зонду	кольцРНК, соответствующая модельному оДНК
cs_1	CAATGGGGAAGTCCT	hsa_circ_0031263 [16]
cs_2	GGAAATGGCTTTTAA	hsa_circ_0072715 [16]
cs_3	TGGGTGCAGAGCTAC	hsa_circ_0136666 [16]

ДНК-зонд – фрагмент ДНК, комплементарный участкам целевых биомолекул; кольцРНК – кольцевая РНК; оДНК – короткий фрагмент (олигонуклеотид) молекулы ДНК

 

Для того чтобы установить минимальную концентрацию, необходимую для обнаружения целевых биомолекул, проводили измерения с использованием НП-чипа с иммобилизованными оДНК-зондами с применением модельных оДНК, аналогичных выбранным участкам целевых кольц-РНК: регистрировали изменение сигнала, полученного от чувствительных элементов НП-чипа, в зависимости от времени. Измерения проводили в 1 мМ калий-фосфатном буферном растворе (КФБ, pH = 7,4) аналогично описанной ранее методике, при постоянном напряжении на затворе V_g = 35 В и напряжении между контактами НП (сток – исток) V_ds = 0,1 В [30–33, 37, 38]. В экспериментах 150 мкл 1 мM КФБ, содержащего фиксированную концентрацию (10^-17, 10^-16, 10^-15 или 10^-14 М) модельного оДНК, добавляли в измерительную ячейку, которая была установлена на НП-чипе и содержала 300 мкл 1 мM КФБ. Первыми выполняли измерения с использованием раствора, содержащего наименьшую концентрацию модельного оДНК (10^-17 М). После добавления раствора модельного оДНК и измерения сигнала, полученного от чувствительных элементов НП-чипа, в течение 10 мин раствор, содержащий оДНК, откачивали из измерительной ячейки и добавляли в нее чистый 1 мМ КФБ, в конце промывали ячейку и НП-чип 50 мл горячей (90 °C) деионизированной воды. После этого повторяли весь цикл, проводя аналогичные измерения с использованием раствора модельного оДНК с более высокой концентрацией: 10^-16 (10^-15 и 10^-14) М.

Детекция целевых кольцевых РНК в плазме крови пациентов с колоректальным раком

С целью исследования применимости НП-чипов с иммобилизованными оДНК для детекции целевых кольцРНК hsa_circ_0136666_CBC1, hsa_circ_0031263_CBC1 и hsa_circ_0072715_CBC1 в плазме крови проводили измерения с использованием НП-чипа с иммобилизованными оДНК-зондами и образцов РНК, выделенных из плазмы крови больных КРР либо пациентов без онкологических заболеваний (контрольные образцы). В этих экспериментах также регистрировали изменение сигнала, полученного от чувствительных элементов НП-чипа, в зависимости от времени. Измерения проводили в 1мМ КФБ (pH = 7,4). В этих экспериментах 7 мкл 1 мM КФБ, содержащего суммарную РНК, выделенную из исследуемого образца плазмы крови, добавляли в измерительную ячейку, которая была установлена на НП-чипе и содержала 100 мкл 1 мM КФБ. В холостых опытах для учета неспецифического сигнала использовали чистый буфер КФБ из протокола для выделения суммарной РНК, не содержащий нуклеиновых кислот.

Этическая экспертиза

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией, разработанной Всемирной медицинской ассоциацией. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Института урологии и репродуктивного здоровья человека Сеченовского Университета (протокол № 10-19 от 17.07.2019). Каждый участник исследования дал письменное информированное согласие на использование своего биологического материала в экспериментах.

Результаты

Определение нижнего концентрационного предела обнаружения с использованием модельных олигонуклеотидов ДНК

На I этапе исследования определяли нижний концентрационный предел обнаружения целевых молекул нуклеиновых кислот при помощи НП-чипов с иммобилизованными оДНК, комплементарными целевым молекулам. На рис. 3 приведен пример типичных зависимостей сигнала (ΔI_ds), идущего от контактов чувствительных элементов НП-чипа с иммобилизованными оДНК-зондами, от времени, установленных в ходе экспериментов с синтетическими модельными оДНК, аналогичными выбранным участкам кольцРНК и комплементарными оДНК-зонду probe_1 (в диапазоне концентраций модельной оДНК от 10^-17 до 10^-14 М).

 

Рис. 3. Типичные зависимости сигнала (ΔI_ds) между контактами чувствительного элемента чипа (нанопровода, НП) с иммобилизованным ДНК-олигонуклеотидным зондом (оДНК-зондом) от времени, полученные в экспериментах с синтетическими модельными оДНК. Экспериментальные условия: концентрация модельной оДНК от 10^-17 до 10^-14 М; оДНК-зонд probe_1, комплементарный кольцевой РНК hsa_circ_0031263; 1 мМ калий-фосфатный буферный раствор (pH = 7,4); напряжение на затворе V_g = 35 В; напряжение между контактами НП V_ds = 0,1 B; объем раствора в ячейке 450 мкл. Стрелкой отмечен момент добавления раствора модельной оДНК

 

Как видно на рис. 3, при добавлении растворов синтетических оДНК с концентрациями от 10^-16 до 10^-14 М сигнал от чувствительных элементов НП-чипа уменьшается (кривые идут вниз) и уровень сигнала, как и ожидалось, увеличивается по абсолютной величине (модулю). При этом с уменьшением концентрации модельного оДНК наблюдался меньший уровень сигнала. При концентрации модельного оДНК 10^-17 М сигнал был сопоставим с уровнем контрольного сигнала. Можно сделать вывод о том, что концентрационный предел обнаружения целевых биомолекул (минимальная детектируемая их концентрация) составил 10^-16 М.

Детекция кольцевых РНК в образцах суммарной РНК, выделенной из плазмы крови пациентов с колоректальным раком

На II этапе исследования изучали применимость НП-чипов с иммобилизованными оДНК для детекции целевых кольцРНК в образцах РНК, выделенных из плазмы крови больных КРР. В качестве контрольных использовали образцы РНК, выделенные из плазмы крови пациентов без онкопатологии. На рис. 4А отображены типичные зависимости сигнала, идущего от чувствительных элементов НП-чипа, от времени, которые были установлены при исследовании образцов суммарной РНК, выделенной из образца № К193 плазмы крови больного КРР. Для сравнения на рис. 4Б показаны зависимости, установленные при исследовании суммарной РНК, выделенной из образца плазмы крови условно здорового пациента.

 

Рис. 4. Типичные зависимости сигнала (ΔI_ds) между контактами чувствительных элементов нанопроводного (НП) чипа с иммобилизованными ДНК-олигонуклеотидными зондами (оДНК-зондами) от времени, полученные с помощью НП-чипа в экспериментах по обнаружению комплементарных кольцевых РНК (кольцРНК), выделенных из плазмы крови: А – пациента с колоректальным раком (образец № К193); Б – пациента без онкопатологии (контрольный образец № 26р). Экспериментальные условия: НП с иммобилизованными оДНК-зондами probe_1, probe_2, probe_3, комплементарными кольцевым РНК hsa_circ_0031263, hsa_circ_0072715, hsa_circ_0136666 соответственно; 1 мМ калий-фосфатный буферный раствор (pH = 7,4); напряжение на затворе V_g = 35 В; напряжение между контактами нанопровода V_ds = 0,1 B. Стрелкой отмечен момент добавления исследуемого образца кольцРНК

 

Как видно на рис. 4А, при добавлении образца, содержащего пул исследуемых кольцРНК, выделенных из плазмы крови больного КРР, наблюдалось значительное увеличение абсолютной величины уровня сигнала от НП с иммобилизованными оДНК-зондами, что свидетельствует о присутствии в исследуемом образце целевых кольц-РНК. Напротив, при исследовании контрольного образца, содержащего РНК, выделенную из плазмы крови пациента без онкологических заболеваний, сигнал от НП изменялся весьма незначительно (см. рис. 4Б). Этот факт свидетельствует об отсутствии в исследуемом образце целевых кольцРНК в детектируемых концентрациях (выше 10^-17 М).

Обсуждение

В настоящей работе при помощи НП-чипов с иммобилизованными оДНК-зондами был определен нижний концентрационный предел обнаружения кольцРНК hsa_circ_0136666_CBC1, hsa_circ_0031263_CBC1 и hsa_circ_0072715_CBC1, ассоциированных с развитием КРР: он составил 10^-16 М. Экспериментально продемонстрирована применимость этих НП-чипов для неинвазивной детекции трех указанных кольцРНК в образцах суммарной РНК, выделенных из плазмы крови пациентов с КРР.

В исследовании использовались НП-чипы, на поверхности чувствительных элементов которых были иммобилизованы оДНК-зонды, комплементарные целевым кольцРНК – hsa_circ_0136666_CBC1, hsa_circ_0031263_CBC1 и hsa_circ_0072715_CBC1. Известно, что эти кольцРНК экспрессируются в тканях, циркулируют в крови и их уровень повышен при КРР [16].

Наше исследование включало два основных этапа. На I этапе были выполнены эксперименты по детекции синтетических модельных оДНК, нуклеотидная последовательность которых была аналогична кольцРНК, ассоциированным с КРР. Опыты проводились с целью определения нижнего концентрационного предела их обнаружения с помощью НП-чипов. Минимальная детектируемая концентрация модельных оДНК, при которых наблюдался четко различимый сигнал от нанопроводов, составила 10^-16 М. С учетом того что уровень целевых кольцРНК повышается при КРР [16], полученный результат свидетельствует о принципиальной возможности использования НП-чипов с иммобилизованными оДНК-зондами для диагностики КРР на ранних стадиях. Так, D.M. Rissin и соавт. [39] подчеркивают, что выявление биомолекул – маркеров онкологических заболеваний с концентрационным пределом обнаружения ниже 10^-15 М – принципиально важное направление развития методов диагностики онкологических заболеваний на ранних стадиях.

Задачей II этапа исследования была демонстрация возможности обнаружения кольцРНК в образцах суммарной РНК, выделенных из плазмы крови пациентов с диагнозом КРР. Экспериментально было показано, что использование НП-чипов с иммобилизованными оДНК-зондами позволяет регистрировать присутствие молекул кольцРНК, ассоциированных с КРР, в образцах суммарной РНК, выделенных из плазмы крови пациентов с диагнозом КРР. При исследовании образцов, содержащих кольцРНК, выделенных из плазмы крови больных КРР (см. табл. 1), наблюдался рост сигнала от чувствительных элементов НП-чипа. В случае контрольных РНК (от пациентов без онкопатологии) изменение уровня сигнала от НП было незначительным, что свидетельствует об отсутствии детектируемых концентраций целевых кольцРНК. Важно отметить, что целевые кольц-РНК были обнаружены в образцах от больных КРР I стадии (см. табл. 1), что подтверждает принципиальную возможность использования НП-чипов с иммобилизованными оДНК-зондами для ранней диагностики КРР.

Ограничения исследования

К ограничениям настоящего исследования следует отнести лимитированную панель кольцРНК, уровень которых в плазме крови повышен при КРР [16]. Необходимо отметить, что при проведении медикаментозной терапии присутствие лекарственных веществ в крови пациентов может оказывать влияние на результаты детекции с помощью НП-чипов. Этот аспект должен быть изучен дополнительно. Среди ограничений метода детекции молекул РНК с использованием НП-чипов следует также назвать наличие верхнего концентрационного предела обнаружения молекул кольцРНК на уровне 10^-13 М [31].

Заключение

Ассоциируемые с КРР кольцРНК – hsa_circ_0031263, hsa_circ_0072715 и hsa_circ_0136666 – были выделены из плазмы крови пациентов с установленным диагнозом КРР и определены с помощью НП-чипов. На поверхности чувствительных элементов НП-чипов были иммобилизованы оДНК-зонды, комплементарные выбранным целевым молекулам кольцРНК. В экспериментах по детекции синтетических модельных оДНК – аналогов целевых кольцРНК – показано, что использование НП-чипов позволяет обнаруживать целевые молекулы в буферном растворе при их концентрациях вплоть до нижнего концентрационного предела обнаружения – 10^-16 М. При регистрации целевых кольцРНК было показано, что НП-чипы позволяют регистрировать присутствие этих кольцРНК в образцах суммарной РНК, выделенной из плазмы крови пациентов с установленным диагнозом КРР; при этом в образцах, выделенных из плазмы крови пациентов без онкологических заболеваний, сигналы НП-чипов отсутствовали.

Полученные результаты подтверждают, что благодаря высокой чувствительности НП-чипы могут использоваться в диагностических устройствах для задач скрининга онкологических заболеваний, а также применяться в диагностике КРР для неинвазивной детекции маркерных кольцРНК в плазме крови.

Дополнительная информация

Финансирование

Биосенсорные измерения на нанопроводном детекторе выполнены в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 годы) (№ 122030100168-2). Работа по подготовке биосенсорных чипов к анализу выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (Государственное задание № 075-00270-24-00).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов

Ю.Д. Иванов – концепция и дизайн исследования и статьи, разработка метода детекции кольцРНК с помощью НП-чипов, анализ полученных данных, редактирование текста, утверждение итогового варианта рукописи; Е.Д. Неведрова и А.В. Виноградова – сбор и обработка материала, анализ полученных данных, написание текста; К.В. Голдаева и А.Ф. Козлов – анализ полученных данных, написание текста; Т.О. Плешакова – концепция и дизайн исследования, анализ полученных данных, написание текста; Р.А. Галиуллин – дизайн экспериментальной части исследования, написание текста; А.Н. Аблеев – анализ и интерпретация полученных данных, написание текста; И.Д. Шумов – анализ и интерпретация полученных данных, работа с графическим материалом, написание и редактирование текста; В.П. Попов – дизайн экспериментальной части исследования, разработка метода детекции кольцРНК с помощью НП-чипов, анализ полученных данных, написание текста; Н.Е. Кушлинский – дизайн клинической части исследования, сбор и анализ клинического материала, редактирование текста, утверждение итогового варианта рукописи; И.С. Стилиди, З.З. Мамедли, Д.В. Еникеев – дизайн клинической части исследования, интерпретация результатов, финальное редактирование текста; Н.В. Потолдыкова – сбор и анализ клинического материала, лечение больных, финальное редактирование текста; В.А. Конев и О.Б. Ковалев – анализ клинико-экспериментальных данных, написание и редактирование текста; В.С. Зиборов – дизайн экспериментальной части исследования, написание текста; Л.И. Гришин – анализ экспериментальных данных, написание и редактирование текста; А.Ю. Долгобородов и О.Ф. Петров – физико-математический анализ полученных данных, написание текста; А.И. Арчаков – концепция и дизайн исследования, разработка метода детекции кольцРНК с помощью НП-чипов, сбор и обработка материала, анализ полученных данных, написание текста, утверждение итогового варианта рукописи. Все авторы прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией, согласны нести ответственность за все аспекты работы и гарантируют, что ими надлежащим образом были рассмотрены и решены вопросы, связанные с точностью и добросовестностью всех частей работы.

Об авторах

Юрий Дмитриевич Иванов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»; ФГБУН Объединенный институт высоких температур Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: yurii.ivanov.nata@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5041-1914
SPIN-код: 7935-0461
Scopus Author ID: 7202332547
ResearcherId: F-5608-2017

д-р биол. наук, профессор, зав. лабораторией нанобиотехнологии, вед. науч. сотр.

Россия, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10–8; 125412, г. Москва, ул. Ижорская, 13–2

Екатерина Дмитриевна Неведрова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Email: nevedrova.kat@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2767-2299

мл. науч. сотр., лаборатория нанобиотехнологии

Россия, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10–8

Ангелина Владимировна Виноградова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Email: angeluna1234@bk.ru
ORCID iD: 0009-0001-6044-3490

мл. науч. сотр., лаборатория нанобиотехнологии

Россия, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10–8

Кристина Витальевна Голдаева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Email: goldaeva_1996@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4082-1247
Scopus Author ID: 57287158900
ResearcherId: AAC-8364-2022

мл. науч. сотр., Научный центр мирового уровня

Россия, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10–8

Татьяна Олеговна Плешакова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Email: topleshakova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3217-9095
Scopus Author ID: 6602765854
ResearcherId: D-9167-2012

д-р биол. наук, заместитель директора по научной работе

Россия, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10–8

Рафаэль Анварович Галиуллин

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Email: rafael.anvarovich@gmail.com

ведущий программист лаборатории исследований единичных биомакромолекул

Россия, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10–8

Александр Нариманович Аблеев

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Email: ableev@mail.ru

ведущий инженер лаборатории нанобиотехнологии

Россия, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10–8

Иван Дмитриевич Шумов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Email: shum230988@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9795-7065
SPIN-код: 3827-1620
Scopus Author ID: 55453193700
ResearcherId: F-5586-2017

канд. биол. наук, науч. сотр. лаборатории нанобиотехнологии

Россия, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10–8

Андрей Федорович Козлов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Email: afkozlow@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2117-8743

ведущий инженер лаборатории нанобиотехнологии

Россия, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10–8

Владимир Павлович Попов

ФГБУН Институт физики полупроводников им. А.В. Ржанова Сибирского отделения Российской академии наук

Email: popov@isp.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-7415-1405

д-р физ.-мат. наук, зав. лабораторией № 10 физических основ материаловедения кремния

Россия, 630090, г. Новосибиpск, пp. Академика Лавpентьева, 13

Николай Евгеньевич Кушлинский

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: biochimia@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3898-4127

д-р мед. наук, профессор, академик РАН, научный руководитель клинико-диагностической лаборатории консультативно-диагностического центра

Россия, 115522, г. Москва, Каширское шоссе, 24

Иван Сократович Стилиди

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: info@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0002-0493-1166

д-р мед. наук, профессор, академик РАН, директор

Россия, 115522, г. Москва, Каширское шоссе, 24

Заман Заурович Мамедли

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: z.z.mamedli@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9289-1247

д-р мед. наук, доцент, зав. отделением абдоминальной онкологии № 3 (колопроктологии)

Россия, 115522, г. Москва, Каширское шоссе, 24

Дмитрий Викторович Еникеев

ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)

Email: enikeev_dv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7169-2209

д-р мед. наук, профессор, хирург-уролог, Институт урологии и репродуктивного здоровья человека

Россия, 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, 8/2

Наталья Валерьевна Потолдыкова

ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)

Email: natalis8282@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9947-9725

врач-уролог, Институт урологии и репродуктивного здоровья человека

Россия, 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, 8/2

Владимир Александрович Конев

ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

Email: konev60@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1566-1771

канд. мед. наук, доцент, кафедра инфекционных болезней у детей, педиатрический факультет

Россия, 117997, г. Москва, ул. Островитянова, 1

Олег Борисович Ковалев

ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

Email: doctor87@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-0273-6700

д-р мед. наук, профессор, кафедра инфекционных болезней у детей, педиатрический факультет

Россия, 117997, г. Москва, ул. Островитянова, 1

Вадим Серафимович Зиборов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»; ФГБУН Объединенный институт высоких температур Российской академии наук

Email: ziborov.vs@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7942-3337

канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр. лаборатории № 6.2 (ударно-волновых воздействий); ведущий специалист лаборатории нанобиотехнологии

Россия, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10–8; 125412, г. Москва, ул. Ижорская, 13–2

Леонид Игоревич Гришин

ФГБУН Объединенный институт высоких температур Российской академии наук

Email: lenya-grishin@mail.ru

науч. сотр. лаборатории № 6.2 (ударно-волновых воздействий)

Россия, 125412, г. Москва, ул. Ижорская, 13–2

Александр Юрьевич Долгобородов

ФГБУН Объединенный институт высоких температур Российской академии наук

Email: aldol@ihed.ras.ru
ORCID iD: 0000-0001-7054-7341

д-р физ.-мат. наук, зав. лабораторией № 6.2 (ударно-волновых воздействий)

Россия, 125412, г. Москва, ул. Ижорская, 13–2

Олег Федорович Петров

ФГБУН Объединенный институт высоких температур Российской академии наук

Email: ofpetrov@ihed.ras.ru

д-р физ.-мат. наук, академик РАН, директор

Россия, 125412, г. Москва, ул. Ижорская, 13–2

Александр Иванович Арчаков

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича»

Email: alexander.archakov@ibmc.msk.ru
ORCID iD: 0000-0002-2290-8090

д-р биол. наук, академик РАН, профессор, научный руководитель

Россия, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10–8

Список литературы

Дополнительные файлы