Filipenko Maksim Leonidovich – PhD (Biol.), Head of Laboratory of Pharmacogenomics, Research Fellow
Филипенко Максим Леонидович – кандидат биологических наук, заведующий лабораторией фармакогеномики, научный сотрудник
Shamovskaya Dar'ya Vadimovna – Research Fellow
Шамовская Дарья Вадимовна – сотрудник
Oskina Natal'ya Aleksandrovna – Research Fellow
Оськина Наталья Александровна – сотрудник
Oscorbin Igor Petrovich – Research Fellow, PhD student
Оскорбин Игорь Петрович – сотрудник, аспирант
Khrapov Evgeniy Aleksandrovich – Research Fellow; Novosibirsk State University
Храпов Евгений Александрович – сотрудник
Ovchinnikova Larisa Konstantinovna – PhD, Surgeon-Oncologist, Department of Mammary Gland Tumors
Овчинникова Лариса Константиновна – кандидат медицинских наук, хирург-онколог, отделение опухолей молочных желез
Gershteyn Elena Sergeevna – Doctor of Biol. Sci., Professor, Leading Research Fellow, Clinical Biochemistry Laboratory
Герштейн Елена Сергеевна – доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической биохимии
Kushlinskii Nikolay Evgen'evich – MD, PhD, Professor, Member-Correspondent of Russian Academy of Sciences, Head of Clinical Biochemistry Laboratory
Кушлинский Николай Евгеньевич – доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией клинической биохимии
Aim: To develop a highly sensitive real-time polymerase chain reaction (PCR) system for detection of somatic mutations in 542 and 545 codons of exon 9 and 1047 codon of exon 20 of PIK3CA gene comprising more than 80% of all somatic mutations in this gene for application on histological material without macroand microdissection, and to analyze associations between these mutations and clinical and pathological characteristics of breast tumors.Materials and methods: The Allele-specific real-time PCR method with signal detection by TaqMan probes was used. For determination of its analytical sensitivity, plasmids carrying the mutations studied were constructed by standard genetic engineering methods using mutagenesis. DNA samples carrying various mutated/wild type DNA ratios (5.0; 2.0; 1.0; 0.5, 0.25%) were prepared. Results: Multiplex allele-specific real-time PCR method for detection of most common mutations in PIK3CA gene: p.E542K c.1624G>A, p.E545K c.1633G>A, p.H1047R c.3140A>G, p.H1047L c.3140A>T – was developed and optimized.Analytical sensitivity of mutation detection comprised 0.5% for p.E542K and 0.25% for p.E545K, p.H1047R and H1047L enzyme.Conclusion: The method developed for detection of somatic mutations in PIK3CA gene is sufficiently sensitive, specific and efficient, that allows to propose it for a routine screening in clinical diagnostic laboratories for evaluation of disease prognosis and monitoring of response to therapy and its modification.
Цель – разработать высокочувствительную систему для выявления соматических мутаций в кодонах 542 и 545 экзона 9 и в кодоне 1047 экзона 20 гена PIK3CA, составляющих более 80% всех соматических мутаций этого гена, с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени для работы с гистологическим материалом без проведения макро и микродиссекции и произвести анализ ассоциаций этих мутаций с клиническими и морфологическими характеристиками опухолей молочной железы.Материал и методы. Применен метод аллель-специфичной ПЦР с детекцией сигнала с помощью TaqMan зондов. Для определения его аналитической чувствительности стандартными генно-инженерными методами с использованием мутагенеза были сконструированы плазмиды, несущие исследуемые мутации, приготовлены образцы ДНК, несущие разный процент мутации относительно дикого типа (5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,25%).Результаты. Проведена разработка и оптимизация мультиплексной аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени для выявления наиболее распространенных соматических мутаций в гене PIK3CA: p.E542K c.1624G>A, p.E545K c.1633G>A, p.H1047R c.3140A>G,p.H1047L c.3140A>T. Аналитическая чувствительность выявления мутаций составила 0,5% для p.E542K и 0,25% для p.E545K, p.H1047R и H1047L. Разработанный метод был использован для выявления указанных соматических мутаций в ДНК, выделенной из парафиновых блоков опухолей больных раком молочной железы. Показано, что частота встречаемости соматических мутаций гена PIK3CA увеличивается по мере прогрессии опухоли – 9,6% в опухолях I–II стадии против 21% в опухолях III–IV стадии (83 и 324 образца соответственно, p = 0,022) в основном за счет увеличения встречаемости мутации p.H1047R c.3140A>G, локализованной в каталитическом домене фермента.Заключение. Разработанный метод детекции соматических мутаций в гене PIK3CA является достаточно чувствительным, специфичным и производительным, что позволяет рекомендовать данную методику для потокового скрининга в клинико-диагностической лаборатории с целью прогнозирования течения заболевания, мониторинга ответа опухоли на терапию и ее коррекции.