Almanac of Clinical MedicineAlmanac of Clinical MedicineАльманах клинической медицины2072-05052587-9294Moscow Regional Research and Clinical Institute (MONIKI)1722810.18786/2072-0505-2024-52-017ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИResearch ArticleIdentification of activating somatic mutations in the PIK3CA gene in breast tumors and determination of their minimal set for clinical diagnostic testingВыявление активирующих соматических мутаций в гене PIK3CA в опухолях молочной железы и определение их минимального набора для клинико-диагностического тестированияhttps://orcid.org/0000-0002-5660-2276BoyarskihUlyana A.БоярскихУльяна Александровна
Russian Federation

PhD (in Biol.), Research Fellow, Laboratory of Pharmacogenomics

канд. биол. наук, науч. сотр. лаборатории фармакогеномики

boyarskih.u@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-4822-0251KechinAndrey A.КечинАндрей Андреевич
Russian Federation

PhD (in Biol.), Research Fellow, Laboratory of Pharmacogenomics

канд. биол. наук, науч. сотр. лаборатории фармакогеномики

a.a.kechin@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-6758-4800ZyuzyukinaAlyona V.ЗюзюкинаАлена Владимировна
Russian Federation

MD, PhD, Oncologist, Associate Professor, Chair of Oncology and Radiation Therapy with Postgraduate Course

канд. мед. наук, врач-онколог; доцент кафедры онкологии и лучевой терапии с курсом последипломного образования

alena-vz@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0991-5349KhrapovYevgeny A.ХраповЕвгений Александрович
Russian Federation

Junior Research Fellow, Laboratory of Pharmacogenomics

мл. науч. сотр. лаборатории фармакогеномики

khrap80@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-3754-5824OscorbinIgor P.ОскорбинИгорь Петрович
Russian Federation

PhD (in Biol.), Research Fellow, Laboratory of Pharmacogenomics

канд. биол. наук, науч. сотр. лаборатории фармакогеномики

osc.igor@gmail.comAlexeenokYefim Y.АлесеенокЕфим Юрьевич
Russian Federation

старший лаборант, Laboratory of Pharmacogenomics

ст. лаборант лаборатории фармакогеномики

alekseenokefim@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0005-0264-9377AvdiyukGalina A.АвдиюкГалина Александровна
Russian Federation

MD, PhD, Associate Professor, Chair of Obstetrics and Gynecology of the Medical Faculty

канд. мед. наук, доцент кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета

galasoft@bk.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7210-3020ZukovRuslan A.ЗуковРуслан Александрович
Russian Federation

MD, PhD, Professor, Chief Physician, Head of Chair of Oncology and Radiation Therapy

д-р мед. наук, профессор, главный врач; зав. кафедрой онкологии и лучевой терапии с курсом ПО

zukov_rus@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3898-4127KushlinskiiNikolay E.КушлинскийНиколай Евгеньевич
Russian Federation

MD, PhD, Professor, Member of Russ. Acad. Sci., Scientific Director of the Clinical Diagnostic Laboratory, Consultative and Diagnostic Center

д-р мед. наук, профессор, академик РАН, научный руководитель клинико-диагностической лаборатории консультативно-диагностического центра

biochimia@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8950-5368FilipenkoMaksim L.ФилипенкоМаксим Леонидович
Russian Federation

Doctor of Biol. Sci., Head of the Laboratory of Pharmacogenomics

д-р биол. наук, зав. лабораторией фармакогеномики

mlfilipenko@gmail.comInstitute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of SciencesИнститут химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наукA.I. Kryzhanovsky Krasnoyarsk Regional Clinical Oncological DispensaryКГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского»Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical UniversityФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава РоссииNovosibirsk State Medical UniversityФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава РоссииN.N. Blokhin National Medical Research Center of OncologyФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России100920245231321391502202423072024Copyright ©; 2024, Boyarskih U.A., Kechin A.A., Zyuzyukina A.V., Khrapov Y.A., Oscorbin I.P., Alexeenok Y.Y., Avdiyuk G.A., Zukov R.A., Kushlinskii N.E., Filipenko M.L.Copyright ©; 2024, Боярских У.А., Кечин А.А., Зюзюкина А.В., Храпов Е.А., Оскорбин И.П., Алесеенок Е.Ю., Авдиюк Г.А., Зуков Р.А., Кушлинский Н.Е., Филипенко М.Л.2024Boyarskih U.A., Kechin A.A., Zyuzyukina A.V., Khrapov Y.A., Oscorbin I.P., Alexeenok Y.Y., Avdiyuk G.A., Zukov R.A., Kushlinskii N.E., Filipenko M.L.Боярских У.А., Кечин А.А., Зюзюкина А.В., Храпов Е.А., Оскорбин И.П., Алесеенок Е.Ю., Авдиюк Г.А., Зуков Р.А., Кушлинский Н.Е., Филипенко М.Л.https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0https://almclinmed.ru/jour/article/view/17228

Background: For effective screening of breast cancer patients for candidates for target therapy with alpelisib, it is necessary to identify activating somatic mutations in the PIK3CA gene by allele specific polymerase chain reaction (PCR); this requires that an optimal list of mutations should be compiled.

Aim: To determine the spectrum of somatic mutations in the PIK3CA gene in breast cancer tumors by means of high performance sequencing (next generation sequencing, NGS) and to identify their minimal set for clinical diagnostic testing by allele specific PCR.

Methods: Targeted NGS was used to identify mutations in the PIK3CA gene in DNA obtained from paraffin blocks with tumor material from 431 patients with HR+HER2- breast cancer. A set of the most common somatic mutations was also detected by allele specific PCR.

Results: We have developed a set of reagents and a protocol for targeted NGS of frequently mutating regions of the PIK3CA and ESR1 genes, which was used to analyze samples from 451 HR+/HER2- breast cancer patients. Clinically significant activating mutations in the PIK3CA gene were found in 32.7% of the samples (141/431). The frequency of the mutant allele ranged from 0.15 to 0.65. Six mutations were most common: c.3140A>G p.His1047Arg (69), c.1633G>A p.Glu545Lys (32), c.1035T>A p.Asn345Lys (12), c.1624G>A p.Glu542Lys (9), c.3140A>T p.His1047Leu (8), Cys420Arg c.1258T>C (3). In total, these mutations amounted to 94.3% (133/141). In 3.5% of the samples (15/431), there were clinically significant somatic mutations in the ESR1 gene: c.1613A>G p, Asp538Gly (7), c.1610A>C p.Tyr537Ser (6), c.1609T>A p.Tyr537Asn (1), c.1610A>G p.Tyr537Cys (1), causing resistance to hormone therapy in patients with breast cancer. While rare mutations comprised only 5.7% of our sample, we validated a set of reagents to identify the six mutations described above by allele specific PCR. NGS and PCR were completely concordant.

Conclusion: PCR testing of activating somatic mutations of the PIK3CA gene meets the requirements for sensitivity (> 90%) and specificity (100%) for a clinical test and can be used in the selection of patients for targeted therapy with PIK3CA inhibitors.

Обоснование. Для эффективного скрининга больных раком молочной железы с целью назначения таргетной терапии алпелисибом необходимо выявление активирующих соматических мутаций в гене PIK3CA методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР), для разработки которого требуется составить оптимальный список мутаций.

Цель – определение спектра соматических мутаций в гене PIK3CA в опухолях молочной железы методом таргетного высокопроизводительного секвенирования (англ. next generation sequencing, NGS) и установление их минимального набора для рутинного клинико-диагностического тестирования методом аллель-специфичной ПЦР.

Материал и методы. Для определения мутаций в гене PIK3CA в ДНК, полученной из парафиновых блоков с опухолевым материалом 431 пациентки с гормонозависимым HER2-отрицательным (HR+HER2-) раком молочной железы, использовали таргетное NGS. Набор наиболее часто встретившихся соматических мутаций также детектировали с помощью аллель-специ- фичной ПЦР.

Результаты. Нами разработаны набор реагентов и протокол проведения таргетного NGS часто мутируемых районов генов PIK3CA и ESR1, который был применен для анализа образцов HR+HER2- рака молочной железы 431 пациентки. Клинически значимые активирующие мутации в гене PIK3CA выявлены в 32,7% (141/431) образцов. Частота мутантного аллеля варьировала в пределах 15–65%. Наиболее часто встретились 6 мутаций: c.3140A>G p.His1047Arg (69), c.1633G>A p.Glu545Lys (32), c.1035T>A p.Asn345Lys (12), c.1624G>A p.Glu542Lys (9), c.3140A>T p.His1047Leu (8), Cys420Arg c.1258T>C (3). В сумме эти мутации составили 94,3% (133/141). В 3,5% (15/431) образцов обнаружены клинически значимые соматические мутации в гене ESR1 – c.1613A>G p.Asp538Gly (7), c.1610A>C p.Tyr537Ser (6), c.1609T>A p.Tyr537Asn (1), c.1610A>G p.Tyr537Cys (1), обусловливающие резистентность к гормональной терапии пациентов с раком молочной железы. Ввиду того что редкие мутации составили лишь 5,7% выборки, проведена валидация набора реагентов для детекции только 6 вышеперечисленных мутаций методом аллель-специфичной ПЦР. NGS и ПЦР показали полную конкордантность.

Заключение. ПЦР-тестирование активирующих соматических мутаций гена PIK3CA удовлетворяет требованиям к чувствительности (> 90%) и специфичности (100%) теста для клинического применения и может быть использовано при отборе пациентов для проведения таргетной терапии ингибиторами PIK3CA.

PIK3CANGSallele specific polymerase chain reactionbreast cancersomatic mutationsPIK3CANGSаллель-специфичная полимеразная цепная реакциярак молочной железы (РМЖ)соматические мутацииИХБФМ СО РАНICBFM SB RAS121031300045-2Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD, Bagrodia S, Cantley LC, Abraham RT. The PI3K pathway in human disease. Cell. 2017;170(4):605–635. doi: 10.1016/ j.cell.2017.07.029.Chen L, Yang L, Yao L, Kuang XY, Zuo WJ, Li S, Qiao F, Liu YR, Cao ZG, Zhou SL, Zhou XY, Yang WT, Shi JX, Huang W, Hu X, Shao ZM. Characterization of PIK3CA and PIK3R1 somatic mutations in Chinese breast cancer patients. Nat Commun. 2018;9(1):1–17. doi: 10.1038/s41467-018-03867-9.Samuels Y, Wang Z, Bardelli A, Silliman N, PtakJ, Szabo S, Yan H, Gazdar A, Powell SM, Riggins GJ, Willson JKV, Markowitz S, Kinzler KW, Vogelstein B, Velculescu VE. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 2004;304(5670):554. doi: 10.1126/science.1096502.Alqahtani A, Ayesh HSK, Halawani H. PIK3CA gene mutations in solid malignancies: Association with clinicopathological parameters and prognosis. Cancers (Basel). 2020;12(1):1–18. doi: 10.3390/cancers12010093.Jenkins ML, Ranga-Prasad H, Parson MAH, Harris NJ, Rathinaswamy MK, Burke JE. Oncogenic mutations of PIK3CA lead to increased membrane recruitment driven by reorientation of the ABD, p85 and C-terminus. Nat Commun. 2023;14(1):1–14. doi: 10.1038/s41467-023-35789-6.Yang J, Nie J, Ma X, Wei Y, Peng Y, Wei X. Targeting PI3K in cancer: mechanisms and advances in clinical trials. Mol Cancer. 2019;18(1):26. doi: 10.1186/s12943-019-0954-x.Belli С, Repetto M, Anand S, Porta C, Subbiah V, Curigliano G. The emerging role of PI3K inhibitors for solid tumour treatment and beyond. Br J Cancer. 2023;128(12):2150–2162. doi: 10.1038/s41416-023-02221-1.Faes S, Dormond O. PI3K and AKT: unfaithful partners in cancer. Int J Mol Sci. 2015;169(9):21138–21152. doi: 10.3390/ijms160921138.André F, Ciruelos E, Rubovszky G, Campone M, Loibl S, Rugo HS, Iwata H, Conte P, Mayer IA, Kaufman B, Yamashita T, Lu YS, Inoue K, Takahashi M, Pápai Z, Longin AS, Mills D, Wilke C, Hirawat S, Juric D; SOLAR-1 Study Group. Alpelisib for PIK3CA-mutated, hormone receptor – positive advanced breast cancer. N Engl J Med. 2019;380(20):1929–1940. doi: 10.1056/NEJMoa1813904.André F, Ciruelos EM, Juric D, Loibl S, Campone M, Mayer IA, Rubovszky G, Yamashita T, Kaufman B, Lu YS, Inoue K, Pápai Z, Takahashi M, Ghaznawi F, Mills D, Kaper M, Miller M, Conte PF, Iwata H, Rugo SH. Alpelisib plus fulvestrant for PIK3CA-mutated, hormone receptor-positive, human epidermal growth factor receptor-2-negative advanced breast cancer: final overall survival results from SOLAR-1. Ann Oncol. 2021;32(2):208–217. doi: 10.1016/j.annonc.2020.11.011.Kechin A, Borobova V, Boyarskikh U, Khrapov E, Subbotin S, Filipenko M. NGS-PrimerPlex: high-throughput primer design for multiplex polymerase chain reactions. PLoS Comput Biol. 2020;16(12):e1008468. doi: 10.1371/journal.pcbi.1008468.Boyarskikh UA, Gulyaeva LF, Avdalyan AM, Kechin AA, Khrapov EA, Lazareva DG, Kushlinskii NE, Melkonyan A, Arakelyan A, Filipenko LM. Spectrum of TP53 mutations in BRCA1/2 associated high-grade serous ovarian cancer. Front Oncol. 2020;10:1103. doi: 10.3389/fonc.2020.01103.Kechin A, Khrapov E, Boyarskikh U, Kel A, Filipenko M. BRCA-analyzer: Automatic workflow for processing NGS reads of BRCA1 and BRCA2 genes. Comput Biol Chem. 2018;77:297–306. doi: 10.1016/j.compbiolchem.2018.10.012.Tate JG, Bamford S, Jubb HC, Sondka Z, Beare DM, Bindal N, Boutselakis H, Cole CG, Creatore C, Dawson E, Fish P, Harsha B, Hathaway C, Jupe SC, Kok CY, Noble K, Ponting L, Ramshaw CC, Rye CE, Speedy HE, Stefancsik R, Thompson SL, Wang S, Ward S, Campbell PJ, Forbes SA. COSMIC: The Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D941–D947. doi: 10.1093/nar/gky1015.Vasan N, Razavi P, Johnson JL, Shao H, Shah H, Antoine A, Ladewig E, Gorelick A, Lin TY, Toska E, Xu G, Kazmi A, Chang MT, Taylor BS, Dickler MN, Jhaveri K, Chandarlapaty S, Rabadan R, ReznikE, Smith ML, Sebra R, Schimmoller F, Wilson TR, Friedman LS, Cantley LC, Scaltriti M, Baselga J. Double PIK3CA mutations in CIS increase oncogenicity and sensitivity to PI3Kα inhibitors. Science. 2020;366(6466):714–723. doi: 10.1126/science.aaw9032.Huang Q, Zhou Y, Wang B, Zhao Y, Zhang F, Ding B. Mutational landscape of pan-cancer patients with PIK3CA alterations in Chinese population. BMC Med Genomics. 2022;15(1):146. doi: 10.1186/s12920-022-01297-7.Grinshpun A, Chen V, Sandusky ZM, Fanning SW, Jeselsohn R. ESR1 activating mutations: From structure to clinical application. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2023;1878(1):188830. doi: 10.1016/j.bbcan.2022.188830.Dahlgren M, George AM, Brueffer C, Gladchuk S, Chen Y, Vallon-Christersson J, Hegardt C, Häkkinen J, Rydén L, Malmberg M, Larsson C, Gruvberger-Saal SK, Ehinger A, Loman N, Borg Å, Saal LH. Preexisting somatic mutations of estrogen receptor alpha (ESR1) in early-stage primary breast cancer. JNCI Cancer Spectr. 2021;5(2):pkab028. doi: 10.1093/jncics/pkab028.Kinslow CJ, Tang A, Chaudhary KR, Cheng SK. Prevalence of estrogen receptor alpha (ESR1) somatic mutations in breast cancer. JNCI Cancer Spectr. 2022;6(5):kac060. doi: 10.1093/jncics/pkac060.