Almanac of Clinical MedicineAlmanac of Clinical MedicineАльманах клинической медицины2072-05052587-9294Moscow Regional Research and Clinical Institute (MONIKI)132310.18786/2072-0505-2020-48-026ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИPatient-derived xenograft model of well-differentiated pancreatic neuroendocrine tumor in immunodeficient Balb/c Nude micePDX-модель высокодифференцированной нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы на иммунодефицитных мышах линии Balb/c Nudehttps://orcid.org/0000-0003-1879-6978TrifanovV. S.ТрифановВ. С.
Russian Federation

Vladimir S. Trifanov - MD, PhD, Surgical Oncologist, Department of Abdominal Oncology No. 1 with a Group of Roentgen Endovascular Methods of Diagnostics and Treatment, Leading Research Fellow.

63 14th Liniya, Rostov-on-Don, 344037.

Трифанов Владимир Сергеевич - кандидат медицинских наук, врач-хирург отделения абдоминальной онкологии № 1 с группой рентгенэндоваскулярных методов диагностики и лечения, ведущий научный сотрудник.

344037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63.

https://orcid.org/0000-0002-1397-837XMaksimovA. Yu.МаксимовА. Ю.
Russian Federation

Aleksey Yu. Maksimov - MD, PhD, Professor, Deputy General Director for Prospective Scientific Research.

63 14th Liniya, Rostov-on-Don, 344037.

Максимов Алексей Юрьевич - доктор медицинских наук, профессор, заместитель генерального директора по перспективным научным разработкам.

344037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63.

https://orcid.org/0000-0003-0676-0871GoncharovaA. S.ГончароваА. С.
Russian Federation

Anna S. Goncharova - PhD (in Biology), Head of Experimental Laboratory Center.

63 14th Liniya, Rostov-on-Don, 344037.

Гончарова Анна Сергеевна - кандидат биологических наук, заведующая Испытательным лабораторным центром.

344037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63.

https://orcid.org/0000-0002-3036-6199LukbanovaE. A.ЛукбановаЕ. A.
Russian Federation

Ekaterina A. Lukbanova - Research Fellow, Experimental Laboratory Center.

163 Azovskaya ul., Azov, 346783, Rostov Region.

Tel.: +7 (919) 895 55 63, +7 (928) 191 45 99.

Лукбанова Екатерина Алексеевна - научный сотрудник, Испытательный лабораторный центр.

346783, Ростовская обл., Азов, ул. Азовская, 163.

Тел.: +7 (919) 895 55 63, +7 (928) 191 45 99.

katya.samarskaja@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0889-2720KarnaukhovN. S.КарнауховН. С.
Russian Federation

Nikolay S. Karnaukhov - MD, PhD, Head of Pathology Department, National Medical Research Centre for Oncology; Assistant of the Pathologic Anatomy Chair, Rostov State Medical University.

63 14th Liniya, Rostov-on-Don, 344037; 29 Nakhichevanskiy per., Rostov-on-Don, 344022.

Карнаухов Николай Сергеевич - кандидат медицинских наук, заведующий патологоанатомическим отделением НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина, ассистент кафедры патологической анатомии РостГМУ.

344037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63; 344022, Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29.

https://orcid.org/0000-0002-1566-8906KitS. O.КитС. О.
Russian Federation

Sergey O. Kit - Junior Research Fellow, Experimental Laboratory Center.

63 14th Liniya, Rostov-on-Don, 344037.

Кит Сергей Олегович - младший научный сотрудник, Испытательный лабораторный центр.

344037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63.

https://orcid.org/0000-0001-7823-3865VolkovaA. V.ВолковаА. В.
Russian Federation

Anastasia V. Volkova - Junior Research Fellow, Experimental Laboratory Center.

63 14th Liniya, Rostov-on-Don, 344037.

Волкова Анастасия Владимировна - младший научный сотрудник, Испытательный лабораторный центр.

344037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63.

https://orcid.org/0000-0001-6364-1794ProtasovaT. P.ПротасоваТ. П.
Russian Federation

Tatiana P. Protasova - Research Fellow, Experimental Laboratory Center.

63 14th Liniya, Rostov-on-Don, 344037.

Протасова Татьяна Пантелеевна - научный сотрудник, Испытательный лабораторный центр.

344037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63.

https://orcid.org/0000-0002-8436-7250TkachevS. Yu.ТкачевС. Ю.
Russian Federation

Sergey Yu. Tkachev - Junior Research Fellow, Experimental Laboratory Center.

63 14th Liniya, Rostov-on-Don, 344037.

Ткачев Сергей Юрьевич - младший научный сотрудник, Испытательный лабораторный центр.

344037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63.

https://orcid.org/0000-0003-3753-4463KhodakovaD. V.ХодаковаД. В.
Russian Federation

Darya V. Khodakova - Junior Research Fellow, Experimental Laboratory Center.

63 14th Liniya, Rostov-on-Don, 344037.

Ходакова Дарья Владиславовна - младший научный сотрудник, Испытательный лабораторный центр.

344037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63.

https://orcid.org/0000-0003-0088-2990ZaikinaE. V.ЗаикинаЕ. В.
Russian Federation

Ekaterina V. Zaikina - Junior Research Fellow, Experimental Laboratory Center.

63 14th Liniya, Rostov-on-Don, 344037.

Заикина Екатерина Владиславовна - младший научный сотрудник, Испытательный лабораторный центр.

344037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63.

https://orcid.org/0000-0001-8734-9210MindarM. V.МиндарьМ. В.
Russian Federation

Mariya V. Mindar - Junior Research Fellow, Experimental Laboratory Center.

63 14th Liniya, Rostov-on-Don, 344037.

Миндарь Мария Вадимовна - младший научный сотрудник, Испытательный лабораторный центр.

344037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63.

AkulshinaI. M.АкульшинаИ. М.
Russian Federation

Inna M. Akulshina – Student.

29 Nakhichevanskiy per., Rostov-on-Don, 344022.

Акульшина Инна Михайловна -студентка.

344022, Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29.

National Medical Research Centre for OncologyНациональный медицинский исследовательский центр онкологии Минздрава РоссииRostov State Medical UniversityРостовский государственный медицинский университет Минздрава России300720204821171243007202030072020Copyright ©; 2020, Trifanov V.S., Maksimov A.Y., Goncharova A.S., Lukbanova E.A., Karnaukhov N.S., Kit S.O., Volkova A.V., Protasova T.P., Tkachev S.Y., Khodakova D.V., Zaikina E.V., Mindar M.V., Akulshina I.M.Copyright ©; 2020, Трифанов В.С., Максимов А.Ю., Гончарова А.С., Лукбанова Е.A., Карнаухов Н.С., Кит С.О., Волкова А.В., Протасова Т.П., Ткачев С.Ю., Ходакова Д.В., Заикина Е.В., Миндарь М.В., Акульшина И.М.2020Trifanov V.S., Maksimov A.Y., Goncharova A.S., Lukbanova E.A., Karnaukhov N.S., Kit S.O., Volkova A.V., Protasova T.P., Tkachev S.Y., Khodakova D.V., Zaikina E.V., Mindar M.V., Akulshina I.M.Трифанов В.С., Максимов А.Ю., Гончарова А.С., Лукбанова Е.A., Карнаухов Н.С., Кит С.О., Волкова А.В., Протасова Т.П., Ткачев С.Ю., Ходакова Д.В., Заикина Е.В., Миндарь М.В., Акульшина И.М.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://almclinmed.ru/jour/article/view/1323

Background: Orthotopic patient-derived xenografts (PDX) in immunodeficient mice are recognized as the most adequate neoplastic model due to their ability to maintain primary tumor properties after implantation. They can be used to study anti-neoplastic effects of pharmacological substances in vivo and to investigate characteristics and mechanisms of carcinogenesis. Results of preclinical studies of pharmacological substances obtained with PDX models are virtually no different from those of subsequent clinical trials. Aim: To develop an orthotopic PDX model of a highly differentiated human pancreatic neuroendocrine tumor (pNET) by implanting a fragment of the patient's tumor into the pancreas of immunodeficient mice. Materials and methods: A tumor fragment was obtained from a patient with a highly differentiated pNET G2 and liver metastasis. Fifteen (15) male immunodeficient Balb/c Nude mice with a mass of 22-24 grams were used to establish the orthotopic PDX model of human well-differentiated pNET. A fragment of primary pNET was orthotopically transplanted into the pancreas of 10 animals. A fragment of the metastatic lesion was transplanted into the liver of 5 animals. The animals were followed for up to 45 days. In vivo monitoring of the tumor growth was performed with a magnetic resonance imaging (MRI) system (ClinScan, Bruker BioSpin, Rheinstetten, Germany). At the end of the experiment, animals were euthanized and autopsies were performed, with routine histopathological examination and immunohistochemical study with antibodies to human chromogranin A, synaptophysin, and the marker of proliferative activity (Ki-67) of both original donor tumor and orthotopic pancreatic and liver xenografts. Results: Obvious changes in the mice condition were noticed at 30 days after surgery. They manifested as an increase in abdominal distension, swelling, and cyanosis in the projection of the pancreas. MRI showed a homogeneous neoplasm in the pancreas. At autopsy, the engraftment rate was 73% of all study animals, with yellow masses with even contours and a volume of about 100 cm3 present within the yellow-pink pancreatic tissues. The morphological assessment showed histological similarity between the original patient's tumor and patient-derived xenografts, which were identified as highly differentiated G2 pNETs. At immunohistochemical assessment, the patient's primary and metastatic tumor tissue specimens expressed anti-chromogranin A (full-blown cytoplasmic reaction) and anti-synaptophysin (mild cytoplasmic reaction) antibodies. Ki-67 was positive in 5.2% of the cells. An immunohistochemical study of the orthotopic tumor fragments and heterotopic tumor fragments showed moderate cytoplasmic staining with antibodies to chromogranin A and synaptophysin. The rate of Ki-67 in the orthotopic pNET model and metastatic model does not exceed 5% and 8%, respectively. Conclusion: Engraftment of tumor material after transplantation of human pancreatic cancer was observed in 73% of the cases, which should be considered a good first passage implantation result. The morphological studies confirmed that the orthotopic PDX was a well-differentiated pNET, histologically corresponding to the donor tumor. The model created in the experiment mirrors the histological characteristics of the donor tumor and can be used in preclinical studies of new treatments for well-differentiated pNETs, including those of antitumor activity of new pharmacological substances.

Актуальность. Ортотопические ксенограф-ты человеческих опухолей (patient-derived xenograft - PDX) на иммунодефицитных мышах признаны наиболее адекватной моделью опухолевого процесса благодаря способности сохранять после имплантации первоначальные свойства опухоли. Они могут применяться для изучения противоопухолевого действия фармакологических субстанций in vivo, а также исследования особенностей и механизмов канцерогенеза. Результаты доклинических исследований фармакологических субстанций, полученные на PDX-моделях, практически не разнятся с последующими клиническими испытаниями. Цель - создание ортотопической PDX-модели высокодифференцированной нейроэндокринной опухоли (НЭО) поджелудочной железы (ПЖ) человека путем имплантации фрагмента опухоли пациента в ПЖ иммунодефицитных мышей. Материал и методы. Фрагмент опухоли был взят от пациента с диагнозом высокодифференцированной НЭО ПЖ, G2 с метастазом в печени. Для создания ортотопической PDX-модели НЭО ПЖ человека было использовано 15 самцов иммунодефицитных мышей линии Balb/c Nude массой 22-24 г. Фрагмент первичной НЭО ПЖ был трансплантирован в ПЖ 10 животным. Фрагмент метастаза НЭО в печени был имплантирован в печень 5 мышей. Наблюдение за животными проводили в течение 45 суток. Прижизненное наблюдение за ростом опухоли выполнялось с использованием визуализации на магнитно-резонансном томографе ClinScan. По окончании эксперимента осуществляли эвтаназию и некропсию. Проводили стандартное гистологическое и иммуногистохимическое исследование с антителами к хромогранину А, синаптофизину, маркеру пролиферативной активности (Ki-67) человеческой опухоли донора и ортотопических ксенографтов в ПЖ и печени мышей. Результаты. Видимые изменения в состоянии мышей были замечены спустя 30 дней после операции. Они выражались в увеличении живота, его припухлости и синюшности в проекции ПЖ. Магнитно-резонансная томография показала однородное новообразование в области ПЖ. При некропсии всех исследованных мышей отмечалось приживление опухолевого материала в 73% случаев, при этом в ПЖ желто-розового цвета были обнаружены опухоли желтоватого цвета с четкими контурами объемом около 100 мм3. При морфологическом анализе опухоли донора и реципиентов были гистологически схожи и идентифицированы как высокодифференцированная НЭО ПЖ, G2. При иммуногистохимическом исследовании первичная и метастатическая опухоли пациента экспрессировали антитела к хромограни-ну А (резко выраженная цитоплазматическая реакция) и синаптофизину (слабо выраженная цитоплазматическая реакция). Ki-67 был позитивен в 5,2% клеток. При иммуногистохимическом исследовании модели первичной опухоли и модели метастатической опухоли была выявлена умеренно выраженная цитоплазматическая окраска с антителами к хромогранину А и синаптофизину. Ki-67 в модели первичной НЭО ПЖ не превышал 5%, а в модели метастаза в печени достигал 8%. Заключение. В результате трансплантации опухоли ПЖ человека отмечалось приживление опухолевого материала в 73% случаев, что следует признать хорошим результатом имплантации для первого пассажа. Согласно результатам морфологических исследований, ортотопический ксенографт, полученный от пациента, является высокодифференцированной НЭО ПЖ, G2, то есть гистологически соответствует опухоли пациента-донора. Полученная в нашем эксперименте модель повторяет гистологические особенности донорской опухоли и может найти свое применение в доклинических исследованиях новых методов лечения высокодифференцированных НЭО ПЖ, в том числе в исследованиях противоопухолевой активности новых фармакологических субстанций.

pancreatic neuroendocrine tumor (pNET)orthotopic PDX modelimmunodeficient micexenografttransplantationвысокодифференцированная нейроэндокринная опухоль поджелудочной железыортотопическая PDX-модельиммунодефицитные мышиксенографттрансплантация1. Ehehalt F, Saeger HD, Schmidt CM, Grutz-mann R. Neuroendocrine tumors of the pancreas. Oncologist. 2009;14(5):456-67. doi: 10.1634/theoncologist.2008-0259.2. Halfdanarson TR, Rabe KG, Rubin J, Petersen GM. Pancreatic neuroendocrine tumors (PNETs): incidence, prognosis and recent trend toward improved survival. Ann Oncol. 2008;19(10):1727-33. doi: 10.1093/annonc/mdn351.3. Jeune F, Taibi A, Gaujoux S. Update on the Surgical Treatment of Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Scand J Surg. 2020;109(1):42-52. doi: 10.1177/1457496919900417.4. Dasari A, Shen C, Halperin D, Zhao B, Zhou S, Xu Y, Shih T, Yao JC. Trends in the Incidence, Prevalence, and Survival Outcomes in Patients With Neuroendocrine Tumors in the United States. JAMA Oncol. 2017;3(10):1335-42. doi: 10.1001/jamaoncol.2017.0589.5. Майстренко НА, Ромащенко ПН, Лы-санюк МВ. Диагностика и хирургическое лечение нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта. Анналы хирургической гепатологии. 2016;21(1):13-20. doi: 10.16931/1995-5464.2016113-20.6. Hallet J, Law CH, Cukier M, Saskin R, Liu N, Singh S. Exploring the rising incidence of neuroendocrine tumors: a population-based analysis of epidemiology, metastatic presentation, and outcomes. Cancer. 2015;121(4):589-97. doi: 10.1002/cncr.29099.7. Lawrence B, Gustafsson BI, Chan A, Svejda B, Kidd M, Modlin IM. The epidemiology of gas-troenteropancreatic neuroendocrine tumors. Endocrinol Metab Clin North Am. 2011;40(1): 1-18, vii. doi: 10.1016/j.ecl.2010.12.005.8. Пинский СБ, Белобородов ВА, Батороев ЮК, Дворниченко ВВ. Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы. Сибирский медицинский журнал (Иркутск). 2013;120(5): 12-7.9. Янкин АВ. Нейроэндокринные опухоли желудочно-кишечного тракта. Практическая онкология. 2005;6(4):227-33.10. Vaghaiwalla T, Keutgen XM. Surgical management of pancreatic neuroendocrine tumors. Surg Oncol Clin N Am. 2020;29(2):243-52. doi: 10.1016/j.soc.2019.11.008.11. Черноусов АФ, Егоров АВ, Мусаев ГХ, Фоминых ЕВ, Кондрашин СА, Васильев ИА, Парнова ВА, Анисимова ОВ. Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы: 30-летний опыт клиники факультетской хирургии им. Н.Н. Бурденко. Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2013;(7):13-9.12. Singh S, Chan DL, Moody L, Liu N, Fischer HD, Austin PC, Segelov E. Recurrence in Resected Gastroenteropancreatic Neuroendocrine Tumors. JAMA Oncol. 2018;4(4):583-5. doi: 10.1001/jamaoncol.2018.0024.13. Имянитов ЕН, Моисеенко ВМ. Применение молекулярно-генетического анализа для выбора противоопухолевой цитостатической терапии. Онкогематология. 2007;2(3): 4-8.14. Холоденко РВ, Холоденко ИВ, Доронин ИИ. Опухолевые модели в изучении онкологических заболеваний. Иммунология. 2013;34(5):282-6.15. Wang Y, Cui J, Wang L. Patient-derived xenografts: a valuable platform for clinical and preclinical research in pancreatic cancer. Chin Clin Oncol. 2019;8(2):17. doi: 10.21037/cco.2019.02.04.16. Qiu W, Su GH. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tu-morigenesis and metastasis. Cancer Metastasis Rev. 2013;32(1-2):83-107. doi: 10.1007/s10555-012-9408-2.17. Трифанов ВС, Максимов АЮ, Кит СО, Гончарова АС, Волкова АВ, Лукбанова ЕА, Миндарь МВ, Ходакова ДВ, Ткачев СЮ, За-икина ЕВ, Протасова ТП, авторы; ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России, патентообладатель. Способ трансплантации фрагмента нейроэндокринной опухоли поджелудочной железы человека в поджелудочную железу иммунодефицитных мышей. Пат. RU 2 725 273 C1 Рос. Федерация. Опубл. 05.11.2019.18. Кит ОИ, Дерижанова ИС, Карнаухов НС. Вопросы классификации нейроэндокринных опухолей желудка. Вопросы онкологии. 2016;62(5):573-9.19. Lee NP, Chan CM, Tung LN, Wang HK, Law S. Tumor xenograft animal models for esophageal squamous cell carcinoma. J Biomed Sci. 2018;25(1):66. doi: 10.1186/s12929-018-0468-7.20. Кит ОИ, Колесников ЕН, Максимов АЮ, Протасова ТП, Гончарова АС, Лукбанова ЕА. Методы создания ортотопических моделей рака пищевода и их применение в доклинических исследованиях. Современные проблемы науки и образования. 2019;(2):96 [Интернет]. Доступно на: http://science-education.ru/ru/article/view?id=28606.