Almanac of Clinical MedicineAlmanac of Clinical MedicineАльманах клинической медицины2072-05052587-9294Moscow Regional Research and Clinical Institute (MONIKI)115210.18786/2072-0505-2019-47-057ARTICLESОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИIn vitro и in vivo photodynamic therapy of solid tumors with a combination of riboflavin and upconversion nanoparticlesФотодинамическая терапия солидных опухолей in vitro и in vivo с применением комбинации рибофлавина и наноразмерных апконвертирующих фосфоровhttps://orcid.org/0000-0001-9866-2878SholinaN. V.ШолинаН. В.
Russian Federation

Natal'ya V. Sholina - Postgraduate Student, Junior Research Fellow, Laboratory of Biomarkers and Mechanisms of Tumor Angiogenesis N.N. Blokhin NMRCO; Laboratory of Photon Bioengineering, Institute of Molecular Medicine I.M. Sechenov FMSMU; Laboratory of Laser Biomedicine FSRC"Crystallography and Photonic, RAS.

24 Kashirskoe shosse, Moscow, 115478; 8/2 Trubetskaya ul., Moscow, 119991; 59 Leninsky prospekt, Moscow, 119333, tel.: + 7 (926) 957 96 63

Шолина Наталья Валериевна - аспирант, младший научный сотрудник лаборатории биомаркеров и механизмов опухолевого ангиогенеза НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина, младший научный сотрудник лаборатории фотонной биоинженерии отдела биомедицинской инженерии Института молекулярной медицины ПМГМУ им. И.М. Сеченова, младший научный сотрудник лаборатории лазерной биомедицины ФНИЦ КФ РАН.

115478, Москва, Каширское шоссе, 24, тел.: + 7 (926) 957 96 63; 119991, Москва, ул. Трубецкая, 8/2; 119333, г. Москва, Ленинский проспект, 59

SholinaNV@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-6486-8114AkasovR. A.АкасовР. А.
Russian Federation

Roman A. Akasov - PhD, Research Fellow, Laboratory of Photon Bioengineering, Institute of Molecular Medicine I.M. Sechenov FMSMU; Laboratory of Laser Biomedicine FSRCCrystallography and Photonic, RAS.

8/2 Trubetskaya ul., Moscow, 119991; 59 Leninsky prospekt, Moscow, 119333

Акасов Роман Александрович - PhD, научный сотрудник лаборатории фотонной биоинженерии отдела биомедицинской инженерии Института молекулярной медицины ПМГМУ им. И.М. Сеченова, научный сотрудник лаборатории лазерной биомедицины ФНИЦ КФ РАН.

119991, Москва, ул. Трубецкая, 8/2; 119333,  Москва, Ленинский проспект, 59

https://orcid.org/0000-0002-5694-3492KhochenkovD. A.ХоченковД. А.
Russian Federation

Dmitry A. Khochenkov - PhD (in Biol.), Head of the Laboratory of Biomarkers and Mechanisms of Tumor Angiogenesis N.N. Blokhin NMRCO.

24 Kashirskoe shosse, Moscow, 115478

Хоченков Дмитрий Александрович - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией биомаркеров и механизмов опухолевого ангиогенеза.

115478, Москва, Каширское шоссе, 24

https://orcid.org/0000-0001-9646-1693GeneralovaA. N.ГенераловаА. Н.
Russian Federation

Alla N. Generalova - PhD (in Chem.), Senior Research Fellow, Laboratory of Laser Biomedicine FSRCCrystallography and Photonic, RAS; Laboratory "Polymers for Biology" M.M. Shemyakin - Yu.A. Ovchinnikov IBC, RAS.

59 Leninsky prospekt, Moscow, 119333; 16/10 Miklukho-Maklaya ul., Moscow, 117997

Генералова Алла Николаевна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории лазерной биомедицины ФНИЦ КФ РАН, старший научный сотрудник лаборатории полимеров для биологии ФГБУН ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

119333, Москва, Ленинский проспект, 59; 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

https://orcid.org/0000-0003-1035-3013SemchishenV. A.СемчишенВ. А.
Russian Federation

Vladimir A. Semchishen – PhD (in Phys. and Math.), Leading Research Fellow, Laboratory of Laser Biomedicine.

59 Leninsky prospekt, Moscow, 119333

Семчишен Владимир Анатольевич - кандидат физико-математических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории лазерной биомедицины ФНИЦ КФ РАН.

119333, Москва, Ленинский проспект, 59

https://orcid.org/0000-0002-3900-2949KhaydukovE. V.ХайдуковЕ. В.
Russian Federation

Evgeny V. Khaydukov - PhD (in Phys. and Math.), Head of the Laboratory of Photon Bioengineering, Institute of Molecular Medicine I.M. Sechenov FMSMU; Head of the Laboratory of Laser Biomedicine FSRC"Crystallography and Photonic, RAS.

8/2 Trubetskaya ul., Moscow, 119991; 59 Leninsky prospekt, Moscow, 119333

Хайдуков Евгений Валерьевич - кандидат физико-математических наук, заведующий лабораторией фотонной биоинженерии отдела биомедицинской инженерии Института молекулярной медицины ПМГМУ им. И.М. Сеченова; заведующий лабораторией лазерной биомедицины ФНИЦ КФ РАН.

119991, Москва, ул. Трубецкая, 8/2; 119333, Москва, Ленинский проспект, 59

N.N. Blokhin National Medical Research Centre of OncologyФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава РоссииI.M. Sechenov First Moscow State Medical UniversityФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)Federal Scientific Research Centre Crystallography and Photonics, Russian Academy of SciencesФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАНFederal Scientific Research Centre Crystallography and Photonics, Russian Academy of SciencesФНИЦ Кристаллография и фотоника, РАНM.M. Shemyakin – Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of SciencesФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН221220194776476530111201901112019Copyright ©; 2019, Sholina N.V., Akasov R.A., Khochenkov D.A., Generalova A.N., Semchishen V.A., Khaydukov E.V.Copyright ©; 2019, Шолина Н.В., Акасов Р.А., Хоченков Д.А., Генералова А.Н., Семчишен В.А., Хайдуков Е.В.2019Sholina N.V., Akasov R.A., Khochenkov D.A., Generalova A.N., Semchishen V.A., Khaydukov E.V.Шолина Н.В., Акасов Р.А., Хоченков Д.А., Генералова А.Н., Семчишен В.А., Хайдуков Е.В.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://almclinmed.ru/jour/article/view/1152

Rationale: Riboflavin (vitamin B2) is one of the most promising agents for photodynamic therapy (PDT). However, its use is limited by the excitation in the ultraviolet (UV) and visible spectral ranges and, as a result, by a small penetration into biological tissue not exceeding a few millimeters. This problem could be solved by approaches ensuring excitation of riboflavin molecules within tumor tissues by infrared (IR) light. Upconversion nanoparticles (UCNPs) can be potentially considered as mediators able to effectively convert the exciting radiation of the near IR range, penetrating into biological tissue to a 3 cm depth, into the photoluminescence in the UV and visible spectral ranges.

Aim: To evaluate the efficacy of UCNPs for IR-mediated riboflavin activation in the depth of tumor tissue during PDT. Materials and methods: The water-soluble riboflavin flavin mononucleotide (FMN, Pharmstandard-UfaVITA, Russia) was used as a photosensitizer in in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments were performed on human breast adenocarcinoma SK-BR-3, human glioblastoma U-87 MG, and rat glioma C6 cell lines. Lewis lung carcinoma (LLC) inoculated to hybrid BDF1 mice was used as a model to demonstrate the delivery of FMN to the tumor. UCNPs with a core/shell structure [NaYF4:Yb3+, Tm3+/NaYF4] were used for photoactivation of FMN in vivo. PDT based on FMN, UCNPs and laser radiation 975 nm (IR) was performed on mouse xenografts of human breast adenocarcinoma SKBR-3.

Results: We were able to show that FMN could act as an effective in vitro photosensitizer for SK-BR-3, U-87 MG, and C6 cell lines. FMN IC50 values for glioma cells were ~30 μM, and for SK-BR-3 cell line ~50 μM (24 h incubation, irradiation 4.2 J/cm2). In the LLC model, the appropriate concentration of FMN (30 μM and above) can be achieved in the tumor as a result of systemic administration of FMN (at 2 and 24 hours after injection). The effect of PDT using near IR light for UCNP-mediated excitation of FMN was demonstrated in mouse xenografts SKBR-3, with the tumor growth inhibition of 90±5%.

Conclusion: The study has demonstrated the possibility to use riboflavin (vitamin B2) as a photosensitizer for PDT. The photoexcitation of FMN via the anti-Stokes photoluminescence of UCNPs allows for implementation of the PDT technique with the near IR spectral range.

Обоснование. Рибофлавин (витамин В2) считается одним из наиболее перспективных агентов для фотодинамической терапии. Однако его применение ограничено возбуждением в ультрафиолетовом (УФ) и синем диапазонах спектра и, как следствие, малой (не более нескольких миллиметров) глубиной проникновения в биоткань. Решением данной проблемы видится разработка подходов, обеспечивающих фотовозбуждение молекул рибофлавина под действием инфракрасного (ИК) света в глубине опухолевой ткани. В качестве посредника, способного эффективно преобразовывать возбуждающее излучение ближнего ИК диапазона, проникающее в биоткань на глубину до 3 см, в фотолюминесценцию УФ и видимого диапазона спектра, могут быть рассмотрены наноразмерные апконвертирующие фосфоры (НАФ).

Цель – оценить эффективность использования НАФ для ИК-опосредованной активации рибофлавина в глубине опухолевой ткани при проведении фотодинамической терапии.

Материал и методы. Водорастворимая форма рибофлавина – флавинмононуклеотид (ФМН) (Фармстандарт-УфаВИТА, Россия) – был использован в качестве фотосенсибилизатора в экспериментах in vitro и in vivo. Эксперименты in vitro выполнены на клеточных линиях аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3, глиобластомы человека U-87 MG и глиомы крысы C6. Карцинома легкого Льюис, перевитая мышам-гибридам BDF1, была использована в качестве модели для демонстрации доставки ФМН в опухолевую ткань. Для фотоактивации ФМН in vivo применялись НАФ со структурой «ядро/оболочка» [NaYF4:Yb3+, Tm3+/NaYF4]. Фотодинамическая терапия на основе ФМН, НАФ и лазерного излучения 975 нм проводилась на ксенографтах мыши SK-BR-3.

Результаты. Показано, что ФМН может выступать в качестве эффективного фотосенсибилизатора in vitro в отношении клеточных линий SK-BR-3, U-87 MG и C6. Значения IC50 для клеток глиомы составляли ~30 мкМ ФМН, а для клеток карциномы молочной железы SK-BR-3 ~50 мкМ ФМН (24 ч инкубации, облучение 4,2 Дж/см2). С использованием модели карциномы легкого Льюис установлено, что соответствующая концентрация ФМН (30 мкМ и выше) может быть достигнута в опухоли в результате системного введения ФМН (через 2 и 24 часа после введения). На ксенографтах мыши SK-BR-3 продемонстрирован эффект фотодинамической терапии с использованием света ближнего ИК диапазона для НАФ-опосредованного возбуждения ФМН, торможение роста опухоли при этом составило 90±5%.

Заключение. Продемонстрирована возможность применения рибофлавина (витамина В2) в качестве фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии. Использование подхода, основанного на фотовозбуждении ФМН через антистоксовую фотолюминесценцию НАФ, позволяет реализовать метод фотодинамической терапии с применением света из ближнего ИК диапазона спектра.

riboflavinupconversion nanoparticlesphotodynamic therapyphotosensitizernear infrared lightрибофлавиннаноразмерные апконвертирующие фосфорыфотодинамическая терапияфотосенсибилизаторсвет ближнего инфракрасного диапазона1. Agostinis P, Berg K, Cengel KA, Foster TH, Girotti AW, Gollnick SO, Hahn SM, Hamblin MR, Juzeniene A, Kessel D, Korbelik M, Moan J, Mroz P, Nowis D, Piette J, Wilson BC, Golab J. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer J Clin. 2011;61(4):250–81. doi: 10.3322/caac.20114.2. Dysart JS, Patterson MS. Characterization of Photofrin photobleaching for singlet oxygen dose estimation during photodynamic therapy of MLL cells in vitro. Phys Med Biol. 2005;50(11): 2597–616. doi: 10.1088/0031-9155/50/11/011.3. Allison RR, Sibata CH. Oncologic photodynamic therapy photosensitizers: a clinical review. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2010;7(2):61–75. doi: 10.1016/j.pdpdt.2010.02.001.4. Cardoso DR, Libardi SH, Skibsted LH. Riboflavin as a photosensitizer. Effects on human health and food quality. Food Funct. 2012;3(5):487–502. doi: 10.1039/c2fo10246c.5. Baier J, Maisch T, Maier M, Engel E, Landthaler M, Bäumler W. Singlet oxygen generation by UVA light exposure of endogenous photosensitizers. Biophys J. 2006;91(4):1452–9. doi: 10.1529/biophysj.106.082388.6. Yang MY, Chang CJ, Chen LY. Blue light induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide and flavin adenine dinucleotide on lethality of HeLa cells. J Photochem Photobiol B. 2017;173:325–32. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2017.06.014.7. Ohara M, Fujikura T, Fujiwara H. Augmentation of the inhibitory effect of blue light on the growth of B16 melanoma cells by riboflavin. Int J Oncol. 2003;22(6):1291–5. doi: 10.3892/ijo.22.6.1291.8. Pass HI. Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use. J Natl Cancer Inst. 1993;85(6):443–56. doi: 10.1093/jnci/85.6.443.9. Nadort A, Sreenivasan VK, Song Z, Grebenik EA, Nechaev AV, Semchishen VA, Panchenko VY, Zvyagin AV. Quantitative imaging of single upconversion nanoparticles in biological tissue. PLoS One. 2013;8(5):e63292. doi: 10.1371/journal.pone.0063292.10. Wang M, Abbineni G, Clevenger A, Mao C, Xu S. Upconversion nanoparticles: synthesis, surface modification and biological applications. Nanomedicine. 2011;7(6):710–29. doi: 10.1016/j.nano.2011.02.013.11. Generalova AN, Rocheva VV, Nechaev AV, Khochenkov DA, Sholina NV, Semchishen VA, Zubov VP, Koroleva AV, Chichkova BN, Khaydukova EV. PEG-modified upconversion nanoparticles for in vivo optical imaging of tumors. RSC Adv. 2016;(36):30089–97. doi: 10.1039/C5RA25304G.12. Guller AE, Generalova AN, Petersen EV, Nechaev AV, Trusova IA, Landyshev NN, Nadort A, Grebenik EA, Deyev SM, Shekhter AB, Zvyagin AV. Cytotoxicity and non-specific cellular uptake of bare and surface-modified upconversion nanoparticles in human skin cells. Nano Res. 2015;8(5):1546–62. doi: 10.1007/s12274-014-0641-6.13. Bareford LM, Avaritt BR, Ghandehari H, Nan A, Swaan PW. Riboflavin-targeted polymer conjugates for breast tumor delivery. Pharm Res. 2013;30(7):1799–812. doi: 10.1007/s11095-013-1024-5.14. Thomas TP, Choi SK, Li MH, Kotlyar A, Baker JR Jr. Design of riboflavin-presenting PAMAM dendrimers as a new nanoplatform for cancer-targeted delivery. Bioorg Med Chem Lett. 2010;20(17):5191–4. doi: 10.1016/j.bmcl.2010.07.005.15. Sau A, Sanyal S, Bera K, Sen S, Mitra AK, Pal U, Chakraborty PK, Ganguly S, Satpati B, Das C, Basu S. DNA Damage and apoptosis induction in cancer cells by chemically engineered thiolated riboflavin gold nanoassembly. ACS Appl Mater Interfaces. 2018;10(5):4582–9. doi: 10.1021/acsami.7b18837.16. Jayapaul J, Arns S, Bunker M, Weiler M, Rutherford S, Comba P, Kiessling F. In vivo evaluation of riboflavin receptor targeted fluorescent USPIO in mice with prostate cancer xenografts. Nano Res. 2016;9(5):1319–33. doi: 10.1007/s12274-016-1028-7.17. Rao PN, Levine E, Myers MO, Prakash V, Watson J, Stolier A, Kopicko JJ, Kissinger P, Raj SG, Raj MH. Elevation of serum riboflavin carrier protein in breast cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1999;8(11):985–90.18. Makdoumi K, Goodrich R, Bäckman A. Photochemical eradication of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by blue light activation of riboflavin. Acta Ophthalmol. 2017;95(5):498–502. doi: 10.1111/aos.13409.19. Meinhardt M, Krebs R, Anders A, Heinrich U, Tronnier H. Wavelength-dependent penetration depths of ultraviolet radiation in human skin. J Biomed Opt. 2008;13(4):044030. doi: 10.1117/1.2957970.20. Рочева ВВ, Шолина НВ, Деревяшкин СП, Генералова АН, Нечаев АВ, Хоченков ДА, Семчишен ВА, Хайдуков ЕВ, Степанова ЕВ, Панченко ВЯ. Люминесцентная диагностика опухолей с применением апконвертирующих наночастиц. Альманах клинической медицины. 2016;44(2):227–33. doi: 10.18786/2072-0505-2016-44-2-227-233.