Diagnostic value of tissue mRNA and microRNA expression profiles for differentiating pancreatic cancer from chronic pancreatitis: A pilot study

Full Text

Панкреатическая протоковая аденокарцинома (ПАК) относится к наиболее злокачественным опухолям человека и занимает одно из ведущих мест среди причин смерти от рака [1]. Согласно данным метаанализа, у пациентов с хроническим панкреатитом (ХП) отмечается 22-кратное повышение риска развития ПАК [2]. Выраженные фиброзно-воспалительные изменения паренхимы способны имитировать объемные образования и маскировать наличие карциномы, тогда как внутрипротоковые конкременты и кальцинаты паренхимы дополнительно ограничивают разрешающую способность лучевых методов визуализации, что затрудняет раннюю диагностику ПАК на фоне ХП [3]. Чувствительность цитологического исследования биоматериала, полученного при тонко-игольной аспирационной пункции под контролем эндоскопического ультрасонографического исследования (ЭУС-ТАП), составляет лишь 54% при наличии ХП и достигает 89% при его отсутствии [4].

В условиях недостаточной информативности традиционных методов все большее значение приобретает анализ молекулярно-генетических и эпигенетических профилей опухоли, при котором выявление соматических мутаций в генах-супрессорах TP53 и SMAD4 в биоматериале ЭУС-ТАП в цитологически сомнительных случаях позволяет значительно улучшить дифференциальную диагностику злокачественных и доброкачественных новообразований поджелудочной железы [5]. В качестве перспективных биомаркеров опухолевой трансформации рассматриваются транскрипты опухоль-ассоциированных генов, а также малые некодирующие РНК, в частности микроРНК (miRNA) [5, 6]. Недавние исследования показали потенциальную диагностическую значимость аберрантных паттернов экспрессии микроРНК в опухолевой ткани, позволяющих разграничить ХП и ПАК [7]. Особый интерес представляет исследование регуляторной сети «микроРНК – матричные РНК (мРНК)», так как комплексный анализ ее компонентов служит основой для выявления ключевых патогенетических звеньев канцерогенеза и объективной оценки прогностической ценности молекулярных биомаркеров.

Ранее нашей группой на основании опубликованных транскриптомных сигнатур, ассоциированных с различными неоплазиями поджелудочной железы, была сформирована панель из 17 опухоль-ассоциированных генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла и пролиферации, опухолевый метаболизм, клеточную адгезию, миграцию и инвазию: циклин B1 (CCNB1), гликогенфосфорилаза L (PYGL), белок семейства кинезинов 22 (KIF22), убиквитинконъюгирующий фермент E2 С (UBE2C), циклинзависимая киназа 1 (CDK1), пируваткиназа М1/М2 (PKM), элонгаза жирных кислот 6 (ELOVL6), N-ацилфосфатидилэтаноламин-фосфолипаза D (NAPEPLD), миелоцитоматоз (MYC), клаудин 18 (CLDN18), глипикан 1 (GPC1), мембранно-связанные муцины (MUC1, MUC5AC, MUC4, MUC16), активатор плазминогена урокиназного типа (PLAU) и альфа-2-субъединица интегрина (ITGA2) [8]. Функциональная аннотация указанных генов представлена в дополнительных материалах (приложение, табл. 1).

Данная панель была использована нашей группой для поиска потенциальных молекулярных маркеров дифференциальной диагностики кистозных образований поджелудочной железы при исследовании образцов, полученных при ЭУС-ТАП. Установлено, что экспрессия генов MUC1, ITGA2, ELOVL6 и MUC5AC статистически значимо различалась между муцинозными неоплазиями и кистозными образованиями без потенциала малигнизации (серозные неоплазии и псевдокисты), а уровень экспрессии PKM прогрессивно повышался в зависимости от степени злокачественного потенциала, достигая максимальных значений при ПАК, и оставался низким при ХП [8]. В настоящем исследовании анализ экспрессии 17 мРНК был дополнен профилированием микроРНК, после чего результаты объединены путем реконструкции регуляторных сетей «микроРНК – мРНК» и функционального аннотирования выявленных взаимодействий.

Цель исследования – анализ дифференциальной экспрессии 17 мРНК опухоль-ассоциированных генов и профилей микроРНК в тканевых образцах ПАК и ХП и интегративная оценка регуляторных закономерностей «микроРНК – мРНК» с определением потенциальной диагностической значимости выявленных маркеров.

Материал и методы

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое наблюдательное одномоментное исследование диагностических биомаркеров поискового характера. Исследование выполнено в ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России на образцах ткани поджелудочной железы, полученных в ходе ЭУС-ТАП у пациентов с подозрением на объемные новообразования поджелудочной железы, обследованных с октября 2020 по июль 2023 г. Результаты гистологического исследования использовали в качестве референсного метода для отнесения образцов к группе ПАК или ХП. Критериями исключения были сочетанные онкологические заболевания и новообразования поджелудочной железы другой этиологии. Размер выборки предварительно не рассчитывался.

ЭУС-ТАП выполняли пункционной иглой 22G в рамках стандартного диагностического обследования с целью морфологической верификации диагноза. Биоматериал сразу после пункции (в течение 1 минуты) переносили в криовиалу и помещали в жидкий азот, после чего образцы хранили при -180 °C до выделения РНК. Средняя масса образцов составила 0,45 г при ПАК и 0,35 г при ХП.

Исследование включало два последовательных аналитических этапа с частично перекрывающимися выборками. На первом этапе из тканевых образцов выделяли тотальную РНК с последующей оценкой качества и количества. Профилирование микроРНК методом высокопроизводительного секвенирования было выполнено во всех 18 образцах (13 образцов ПАК и 5 образцов ХП), тогда как оценка экспрессии 17 мРНК-мишеней методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с предварительной реакцией обратной транскрипции была проведена в 15 образцах (10 образцов ПАК и 5 образцов ХП), для которых было получено достаточное количество РНК.

На втором этапе выполняли межгрупповой сравнительный анализ для каждого класса РНК в соответствующей аналитической выборке. Функциональный анализ осуществляли для всех дифференциально экспрессируемых мРНК-мишеней. Биоинформатический анализ профилей микроРНК включал оценку дифференциальной экспрессии микроРНК между ПАК и ХП. Далее проводили интегративный in silico анализ результатов двух аналитических фрагментов. Под интегративным анализом понимали сопоставление данных о дифференциальной экспрессии приоритетных мРНК и микроРНК с целью выявления потенциальных регуляторных связей между двумя классами молекул. Реконструкцию и функциональную интерпретацию взаимодействий «микроРНК – мРНК» выполняли с использованием данных о предсказанных и экспериментально подтвержденных связях, представленных в публичных базах данных.

Оценка экспрессии мРНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени

Относительную экспрессию 17 мРНК (CCNB1, PYGL, KIF22, UBE2C, CDK1, PKM, ELOVL6, NAPEPLD, MYC, CLDN18, GPC1, MUC1, MUC5AC, MUC4, MUC16, PLAU, ITGA2) оценивали методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с предварительной реакцией обратной транскрипции, как описано ранее [8].

Тотальную РНК из биоптатов выделяли с помощью TRIzol (Invitrogen, США), обратную транскрипцию (100 нг РНК каждого образца) проводили со случайными праймерами и набором MMLV RT (Evrogen, Россия). Полимеразную цепную реакцию выполняли с набором qPCRmix-HS SYBR Low ROX (Evrogen, Россия) и ген-специфичными праймерами в технических дупликатах для каждого образца на термoциклере ABI 7500 (Applied Biosystems, США). Определяли среднее значение порогового цикла (Ct), эффективность амплификации (ниже 95% не включали в анализ), специфичность амплификации подтверждали анализом кривых плавления. Экспрессию целевых мРНК рассчитывали по методу 2^-(ΔΔCt) [8].

Оценка экспрессии микроРНК методом высокопроизводительного секвенирования

Библиотеки малых некодирующих РНК готовили с использованием 1 мкг тотальной РНК с помощью TruSeq Small RNA Library Preparation Kit (Illumina, США) с модификациями, как описано ранее [9]. Кратко, количество циклов амплификации составило 16, для лигирования использовали Т4 RNA Ligase. Качество и концентрацию библиотек оценивали на приборе Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, США) с High Sensitivity DNA chips (Agilent Technologies, США). Секвенирование пулированных библиотек выполняли на Illumina MiSeq (Illumina, США) с набором MiSeq ReagentKit v3 (2 × 300).

Биоинформатический анализ был ограничен прочтениями, аннотированными как микроРНК. Биоинформатическую обработку NGS-данных проводили с использованием платформ miRge3.0 (https://mirge3.readthedocs.io/en/latest/) и exceRpt (http://github.gersteinlab.org/exceRpt/). Выравнивание прочтений и аннотацию микроРНК осуществляли с использованием базы данных miRBase (https://www.mirbase.org/) с формированием матриц счетчиков для каждого образца. Дифференциальную экспрессию микроРНК оценивали на основе нормализованных матриц методом limma (R/Bioconductor) с линейной моделью, расчетом logFC (англ. logarithmic fold change – логарифмическое изменение кратности), номинальных значений p и скорректированных значений p методом Бенджамини – Хохберга (p_adj). С учетом поискового характера исследования проводили отбор микроРНК-кандидатов по номинальному значению p < 0,05 и |log₂FC| ≥ 1,0.

Функциональный анализ in silico

Функциональный анализ регуляторных сетей и биомолекулярных процессов для целевых генов проводили с использованием баз KEGG (Киотская энциклопедия генов) и Gene Ontology (GO, онтология генов). Генерацию сети функциональных взаимодействий генов выполняли в ShinyGO 0.85 (http://bioinformatics.sdstate.edu/go/). Анализ регуляторных сетей дифференциально экспрессируемых микроРНК и построение сетей взаимодействий «микроРНК – мРНК» проводили в miRNet 2.0 (https://www.mirnet.ca) с использованием Reactome (встроенного модуля, https://reactome.org).

Этическая экспертиза

Исследование выполнено в соответствии с Хель-синкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации и одобрено этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России (протокол № 2101-23 от 23.01.2023). Все пациенты подписали добровольное информированное согласие.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с использованием StatTech v. 4.6.1 (ООО «Статтех», Россия), визуализацию данных и построение графиков выполняли в среде R с помощью пакета ggplot2 в интегрированной среде разработки RStudio. Количественные данные при нормальном распределении описывали с использованием среднего арифметического и стандартного отклонения (M ± SD), при отличном от нормального – медианы и квартилей (Me [Q1; Q3]). Для анализа независимых категориальных признаков применяли точный критерий Фишера. Различия между двумя группами оценивали с помощью t-критерия для независимых выборок или критерия Манна – Уитни, статистически значимыми считали различия при p < 0,05. Диагностическую значимость изменения относительного уровня экспрессии генов анализировали методом ROC-кривых с расчетом площади под кривой (англ. area under the curve, AUC). Оптимальный порог (cut-off) определяли по индексу Юдена. Для каждого маркера рассчитывали чувствительность, специфичность, 95% доверительный интервал (ДИ) и статистическую значимость AUC (точный критерий Манна – Уитни).

Результаты

Характеристика пациентов

В исследование включено 18 пациентов с подозрением на объемные новообразования поджелудочной железы, которым в 2020–2023 гг. в ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России была выполнена ЭУС-ТАП с целью морфологической верификации диагноза. По данным гистологического исследования у 13 пациентов диагностирована ПАК, у 5 – ХП. Статистически значимых различий между группами по возрасту и полу не выявлено (табл. 1). У пациентов с аденокарциномой опухоль преимущественно локализовалась в головке поджелудочной железы или крючковидном отростке (10/13, 76,9%). Медианный диаметр опухоли составил 35 мм (диапазон 18–39 мм).

 

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

Параметр	Когорта		Значение р
	Протоковая аденокарцинома (n = 13)	Хронический панкреатит (n = 5)
Пол, n (%):
женский	9 (69)	1 (20)	0,12
мужской	4 (31)	4 (80)
Возраст, лет, Mе [IQR]	61,5 [44–84]	63,8 [51–77]	0,76
Сахарный диабет	5 (38,5)	3 (60)	0,60
Локализация, n (%):
головка / крючковидный отросток	10 (77)	–
перешеек / тело / хвост	3 (23)	–
Диаметр, мм, Mе [IQR]	35 [18–39]	–
Стадия рака, n (%):
I–II	6 (46)	–
III–IV	7 (54)	–

Данные представлены как абсолютное число пациентов (n) и их процент в группе или как медиана и межквартильный размах (Mе [IQR])

 

В исследование профиля экспрессии 17 целевых мРНК вошли 5 пациентов с ХП и 10 пациентов с ПАК, у 5 из которых стадия злокачественного процесса была определена как I–II, у 5 пациентов – III–IV.

Анализ относительной экспрессии целевых мРНК

При сравнительном анализе профилей экспрессии мРНК установлены значимые различия между группами ПАК и ХП (рис. 1А; приложение, табл. 2). Дифференциальная экспрессия выявлена для 6 из 17 исследованных генов: в образцах ПАК наблюдалось статистически значимое повышение уровня ITGA2 (р = 0,028), MUC1 (р = 0,019) и PKM (р = 0,0007), тогда как экспрессия CCNB1 (р = 0,039), KIF22 (р = 0,039) и MUС4 (р = 0,033) была значимо снижена по сравнению с группой ХП.

 

Рис. 1. Профили экспрессии 17 целевых мРНК в образцах протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и хронического панкреатита, полученных методом тонкоигольной аспирационной биопсии под контролем ультрасонографического исследования, и диагностическая эффективность MUC1, PKM и ITGA2. А – относительная экспрессия 17 целевых мРНК, ^* статистически значимые различия при p < 0,05, fold change – кратность изменения экспрессии; Б – ROC-кривая для MUC1 (AUC = 0,88, p = 0,019); В – ROC-кривая для ITGA2 (AUC = 0,86, p = 0,028); Г – ROC-кривая для PKM (AUC = 1,00, р = 0,0007)

 

Для оценки диагностической значимости были отобраны три из шести мРНК-мишеней, уровень экспрессии которых статистически значимо различался между ПАК и ХП, а кратность изменения (англ. fold change, FC) превышала 25: MUC1 (FC = 94,7, p = 0,019), ITGA2 (FC = 82,7, p = 0,028) и PKM (FC = 56,5, р = 0,0007). В исследуемой пилотной выборке наилучшую дискриминационную способность продемонстрировал PKM (AUC = 1,00; 95% ДИ 1,000–1,000; р = 0,0007) (рис. 1Б, В, Г, табл. 2).

 

Таблица 2. Оценка дискриминационной способности относительной экспрессии мРНК MUC1, PKM и ITGA2 в образцах протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и хронического панкреатита, полученных методом тонкоигольной аспирационной биопсии под контролем эндоскопического ультрасонографического исследования

Ген	AUC (95% ДИ)	Оптимальное пороговое значение	Чувствительность, % (95% ДИ)	Специфичность, % (95% ДИ)	Индекс Юдена	Значение p
MUC1	0,88 (0,643–1,000)	≥ 52,28	70,0 (34,8–93,3)	100 (47,8–100)	0,700	0,0193
PKM	1,00 (1,000–1,000)	≥ 7,82	100 (69,2–100)	100 (47,8–100)	1,000	0,0007
ITGA2	0,86 (0,520–1,000)	≥ 6,34	100 (69,2–100)	80,0 (28,4–99,5)	0,800	0,0280

AUC (area under the curve) – площадь под кривой, ДИ – доверительный интервал

 

Функциональный анализ дифференциально экспрессируемых генов in silico

Функциональный анализ in silico шести дифференциально экспрессируемых генов (ITGA2, MUC1, PKM, CCNB1, KIF22 и MUC4) позволил идентифицировать 19 значимо обогащенных молекулярных процессов (FDR (англ. false discovery rate – средняя доля ложноположительных результатов) < 0,05), в которых участвовали от одного до трех из анализированных генов (приложение, рисунок). Наибольшее число молекулярных процессов было ассоциировано с генами PKM, ITGA2, MUC1. Среди обогащенных путей наиболее представлены процессы, связанные с активацией пируваткиназ, внутриклеточных тирозинкиназ (посредством рецептора Erbb-2), гистоновых киназ (тип H3), что указывает на вовлеченность данных генов в опухоль-ассоциированные процессы.

Анализ дифференциальной экспрессии микроРНК

При секвенировании малых РНК в 18 биоптатах идентифицировано 1319 микроРНК, однако ни одна из них не достигла порога статистической значимости при множественном тестировании (p_adj < 0,05) между группами ПАК и ХП. Вместе с тем при менее строгих критериях (номинальное значение p < 0,05 и |log₂FC| ≥ 1,0) выявлены различия для 21 микроРНК, экспрессия 16 из которых была понижена, а 5 – повышена в образцах ПАК по сравнению с ХП (рис. 2; приложение, табл. 3). Наиболее выраженное снижение отмечено для hsa-miR-205-5p (logFC = -11,885, р = 0,003), hsa-miR-196-5p (logFC = -7,311, р = 0,004) и hsa-miR-181c-5p (logFC = -6,483, р = 0,004) с кратностью различий 3782,8, 158,8 и 89,4 соответственно. Наиболее выраженное повышение экспрессии зарегистрировано для hsa-miR-146а-5p (logFC = 2,993, р = 0,0001), hsa-miR-378-3p (logFC = 1,604, р = 0,021) и hsa-miR-155-5p (logFC = 1,491, р = 0,019) с кратностью различий 8,0, 3,0 и 2,8 соответственно.

 

Рис. 2. Вулкан-плот дифференциально экспрессируемых микроРНК в образцах протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (ПАК) и хронического панкреатита (ХП), полученных методом тонкоигольной аспирационной биопсии под контролем ультрасонографического исследования; горизонтальная пунктирная линия соответствует p = 0,05, вертикальные – log₂FC = ±1; цветом выделена 21 микроРНК (hsa-miR-), отобранная по критериям дифференциальной экспрессии (синим – с пониженной экспрессией в образцах ПАК относительно ХП, красным – с повышенной), при множественном тестировании (p_adj < 0,05) которых между группами ПАК и ХП не было достигнуто порога статистической значимости. FC (fold change) – кратность изменения экспрессии

 

Интегративный in silico анализ регуляторного взаимодействия «микроРНК – мРНК»

На основании реконструированной сети регуляторных взаимодействий 21 дифференциально экспрессируемой микроРНК с MUC1, PKM, ITGA2 выделены восемь микроРНК с наибольшей функциональной связанностью: hsa-miR-335-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-335-3p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-22-3p и hsa-miR-28-3p (рис. 3). Три микроРНК (hsa-miR-335-5p, hsa-miR-342-3p и hsa-miR-22-3p) были одновременно функционально связаны со всеми тремя генами-мишенями, при этом hsa-miR-335-5p характеризовалась наибольшей степенью связанности в сети (см. рис. 3; приложение, табл. 4).

 

Рис. 3. Сеть регуляторных взаимодействий восьми микроРНК с наибольшей функциональной связанностью с мРНК MUC1, PKM и ITGA2 по данным интегративного in silico анализа; розовые узлы обозначают микроРНК, синие – гены-мишени; ребра (линии) соответствуют прогнозируемым взаимодействиям

 

Обсуждение

В данном исследовании установлено, что гиперэкспрессия мРНК PKM, MUC1 и ITGA2 в тканевых биоптатах поджелудочной железы статистически значимо ассоциирована с ПАК и отличается высокой дискриминационной способностью, что позволяет рассматривать данные транскрипты в качестве перспективных биомаркеров для повышения эффективности морфологической диагностики ПАК на фоне фиброзно-воспалительных поражений паренхимы. Интегративный анализ дифференциально экспрессируемых микроРНК выявил восемь микроРНК, функционально связанных с PKM, MUC1 и ITGA2, среди которых hsa-miR-205-5p и hsa-miR-335-5p являются наиболее перспективными кандидатами для включения в диагностическую панель.

Полученные результаты согласуются с данными о значимой роли PKM, MUC1 и ITGA2 в канцерогенезе, в том числе в развитии и прогрессировании ПАК [10, 11]. PKM кодирует основной фермент гликолиза – пируваткиназу М, которая в опухолевых клетках экспрессируется преимущественно в виде изоформы РКМ2, выступающей ключевым драйвером метаболического переключения гликолиза на эффект Варбурга, что способствует высокой пролиферативной активности клеток [12]. MUC1 кодирует высокогликозилированный трансмембранный муцин, который участвует в регуляции сигнальных путей Wnt/β-катенин, JNK/TGF-β, ERK, активируя клеточное деление и блокировку апоптоза [13]. ITGA2 кодирует альфа-субъединицу трансмембранного рецептора интегрина, который играет ключевую роль в клеточной адгезии и взаимодействии с внеклеточным матриксом, а также активирует Rac1- и CDC42-зависимые сигнальные каскады, что способствует усилению миграции и инвазии опухолевых клеток [11].

Следует отметить, что уровень экспрессии мРНК служит прямым индикатором опухоль-ассоциированных функциональных изменений, тогда как динамика экспрессии микроРНК отражает регуляторные сдвиги. В настоящем исследовании информативность оценивалась не только для отдельных целевых мРНК, но и в контексте их взаимодействия с дифференциально экспрессируемыми микроРНК в биоптатах. Такой подход, с одной стороны, облегчает интерпретацию микроРНК-опосредованных механизмов патогенеза ПАК, с другой, повышает вероятность выбора устойчивых биомаркеров [14]. Актуальность комплексного интегративного анализа обусловлена тем, что анализ экспрессии микроРНК, несмотря на их высокую тканевую специфичность, доступность для оценки в плазме крови и более высокую стабильность по сравнению с мРНК, нередко дает противоречивые результаты из-за технической вариабельности данных, отсутствия унифицированных протоколов нормализации и зависимости от клинико-биологических характеристик исследуемых групп [15].

Интегративный анализ идентифицировал пять микроРНК с пониженной экспрессией (hsa-miR-28-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-335-3p, hsa-miR-335-5p) и три микроРНК с повышенной экспрессией (hsa-miR-22a-3p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-342-3p), тесно функционально связанных с PKM, MUC1 и IGA2. Учитывая супрессирующий эффект микроРНК в отношении мРНК-мишеней, снижение уровня микроРНК-супрессоров может опосредованно приводить к активации транскриптов, вовлеченных в пролиферацию и выживание клеток.

Наиболее выраженное снижение экспрессии отмечалось для hsa-miR-205-5p, ассоциированной с метастатическим потенциалом опухолевых клеток, в том числе за счет участия в регуляции эпителиально-мезенхимального перехода [16]. По данным литературы, miR-205-5p характеризуется как микроРНК-супрессор, ее уровень снижен при ПАК [17]. Пониженная экспрессия hsa-miR-335-5p, являющейся прямым регулятором трансляции мРНК ITGA2, коррелирует с подавлением метастазирования и миграции клеток при различных типах рака [18].

Повышенный уровень hsa-miR-342-3p приводит к формированию устойчивости клеток ПАК к гемцитабину и снижению эффективности терапии [19]. Гиперэкспрессия hsa-miR-155-5p, одной из ключевых онкогенных микроРНК, способствует выживанию и пролиферации опухолевых клеток и формированию провоспалительного микроокружения ПАК [20, 21].

Таким образом, полученные результаты в совокупности с данными литературы свидетельствуют о том, что профили транскриптов PKM, MUC1, ITGA2 и восьми дифференциально экспрессируемых микроРНК (hsa-miR-28-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-335-3p, hsa-miR-335-5p, hsa-miR-22a-3p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-342-3p), ассоциированных с ПАК, представляют собой потенциально взаимосвязанный молекулярный профиль, вовлеченный в перестройку энергетического метаболизма (опосредовано PKM), нарушение клеточной адгезии и эпителиально-мезенхимального перехода (опосредовано MUC1 и ITGA2), а также посттранскрипционную регуляцию сигнальных путей, контролирующих пролиферацию, апоптоз и опухолевую прогрессию (посредством вышеуказанных микроРНК), что подчеркивает многоуровневый характер молекулярных нарушений при канцерогенезе поджелудочной железы.

Ограничением данного исследования следует считать небольшой размер выборки. Перспективы исследований в данном направлении связаны с валидацией результатов на расширенной когорте пациентов, а также проведением интегративного анализа «микроРНК – мРНК» при других неоплазиях поджелудочной железы с целью поиска биомаркеров, ассоциированных с прогрессированием и метастазированием.

Заключение

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о перспективности интегративного анализа «микроРНК – мРНК» для поиска потенциальных молекулярных маркеров дифференциальной диагностики новообразований поджелудочной железы.

Комплексный анализ мРНК и микроРНК в тканевых биоптатах поджелудочной железы, полученных методом ЭУС-ТАП, позволил установить, что гиперэкспрессия PKM, MUC1 и ITGA2 ассоциирована с ПАК, а дополнительное включение в диагностическую модель hsa-miR-205-5p и hsa-miR-335-5p, наиболее значимо сниженной при ПАК и функционально связанной с указанными генами соответственно, потенциально может повысить эффективность ранней дифференциальной диагностики ПАК. Полученные результаты нуждаются в подтверждении в расширенных независимых выборках, а предполагаемые взаимодействия «микроРНК – мРНК» – в экспериментальной валидации.

Приложение

Таблица 1. Функциональная аннотация исследованных генов

Название гена, код доступа согласно базе данных NCBI	Краткое описание функций кодирующих белков согласно аннотации базы данных NCBI
CLDN18 NM_001002026.3	Член семейства клаудинов, интегральных мембранных белков и компонентов плотных межклеточных соединений
GPC1 NM_002081.3	Глипикан 1, клеточный поверхностный гепарансульфатный протеогликан, состоит из ассоциированного с мембраной белкового ядра, замещенного переменным числом цепей гепарансульфата
CDK1 NM_001786.5	Циклинзависимая киназа 1. Член семейства серин/треонин-протеинкиназ. Белок представляет собой каталитическую субъединицу высококонсервативного комплекса протеинкиназ, известного как фактор, способствующий фазе M (MPF), который необходим для перехода из фазы G2 в фазу M эукариотического клеточного цикла
CCNB1 NM_031966.4	Циклин B1. Регуляторный белок, участвующий в митозе
UBE2C NM_007019	Член семейства убиквитин-конъюгирующих ферментов E2. Модификация белков убиквитином – важный клеточный механизм, направляющий аномальные или короткоживущие белки на деградацию
PLAU NM_002658.6	Активатор плазминогена, урокиназа – секретируемая сериновая протеаза, которая превращает плазминоген в плазмин. Кодируемый ею препропротеин подвергается протеолитическому расщеплению с образованием полипептидных цепей А и В
MYC NM_002467.6	MYC – протоонкоген, bHLH-транскрипционный фактор, кодирующий ядерный фосфопротеин, играющий роль в прогрессии клеточного цикла, апоптозе и клеточной трансформации
PKM NM_002654.6	Пируваткиназа М1/М2 – белок, участвующий в гликолизе, который катализирует перенос фосфорильной группы от фосфоенолпирувата к АДФ, генерируя АТФ и пируват
ELOVL6 NM_024090.3	ELOVL – фермент, участвующий в удлинении жирных кислот, который использует малонил-КоА в качестве донора двух атомов углерода на первом и лимитирующем скорость этапе удлинения жирных кислот
NAPEPLD NM_001122838.3	Фермент N-ацилфосфатидилэтаноламинфосфолипаза D катализирует высвобождение N-ацилэтаноламина (NAE) из N-ацилфосфатидилэтаноламина (NAPE) на втором этапе биосинтеза N-ацилэтаноламина
KIF22 NM_007317.3	Белок семейства кинезинов 22 (kinesin family member 22), относится к семейству кинезиноподобных белков. Члены этого семейства представляют собой зависимые от микротрубочек молекулярные моторы, которые транспортируют органеллы внутри клеток и перемещают хромосомы во время клеточного деления
PYGL NM_002863.5	Гликогенфосфорилаза L – гомодимерный белок, катализирующий расщепление альфа-1,4-глюкозидных связей с высвобождением глюкозо-1-фосфата из запасов гликогена в печени
ITGA2 NM_002203.4	Альфа-2-субъединица интегрина трансмембранного рецептора для коллагенов и родственных белков, которая опосредует адгезию тромбоцитов и других типов клеток к внеклеточному матриксу
MUC1 NM_001204291.1	Муцин 1, ассоциированный с клеточной поверхностью, – мембранный белок, принадлежащий к семейству муцинов, который играет важную роль в формировании защитных слизистых барьеров на эпителиальных поверхностях. Эти белки также участвуют во внутриклеточной передаче сигналов
MUC5AC NM_001304359.2	Муцин 5AC, олигомерный слизе-/гелеобразующий компонент, предположительно является структурным элементом внеклеточного матрикса. Предполагается, что он действует на этапах поддержания прозрачности хрусталика или в рамках этого процесса
MUC4 NM_018406.7	Муцин 4, ассоциированный с клеточной поверхностью, является основным компонентом слизи – вязкого секрета, покрывающего эпителиальные поверхности. Этот гликопротеин играет важную роль в защите эпителиальных клеток и участвует в обновлении и дифференцировке эпителия
MUC16 NM_001414686.1	Муцин 16, ассоциированный с клеточной поверхностью, представляет собой мембраносвязанный муцин, содержащий внеклеточный домен на N-конце, большой тандемный повторяющийся домен и трансмембранный домен с коротким цитоплазматическим доменом. Считается, что этот белок играет роль в формировании барьера, защищающего эпителиальные клетки от патогенов

АДФ – аденозиндифосфат, АТФ – аденозинтрифосфат, малонил-КоА – малонилкофермент А

Последовательности праймеров для амплификации целевых генов были ранее опубликованы и приведены в работе [٨]

 

Таблица 2. Уровни относительной экспрессии 17 целевых генов в тканевых образцах протоковой аденокарциномы и хронического панкреатита

Ген (ПАК/ХП)*	FC для хронического панкреатита, Me [IQR]	FC для протоковой аденокарциномы, Me [IQR]	Значение p
CLDN18 (10/5)	1,58 [1, 11; 1, 70]	4,84 [0, 99; 11, 49]	0,254
CDK (8/4)	2,20 [1, 60; 8, 06]	7,09 [4, 52; 20, 13]	0,368
UBE2C (9/5)	1,32 [0, 21; 3, 38]	3,05 [2, 11; 3, 70]	0,606
MUC1 (10/5)	0,60 [0, 28; 1, 49]	56,81 [36, 08; 82, 61]	0,019
NAPEPLD (10/5)	1,79 [0, 18; 2, 93]	6,41 [4, 36; 16, 85]	0,165
MYC (10/5)	1,41 [0, 70; 3, 10]	0,11 [0, 08; 0, 28]	0,154
KIF22 (10/5)	0,80 [0, 57; 2, 60]	0,28 [0, 13; 0, 41]	0,039
PKM (10/5)	0,81 [0, 56; 5, 45]	45,75 [34, 86; 93, 14]	0,0007
ITGA2 (10/5)	0,46 [0, 37; 1, 49]	36,76 [9, 24; 96, 84]	0,028
ELOVL6 (10/5)	2,13 [0, 78; 3, 05]	2,16 [1, 49; 3, 62]	0,768
PYGL (10/5)	5,36 [0, 44; 5, 62]	2,21 [0, 68; 3, 02]	0,657
MUC5AC (10/5)	8,55 [0, 03; 9, 68]	5,29 [2, 76; 6, 83]	0,927
CCNB1 (10/5)	1,25 [0, 70; 1, 88]	0,12 [0, 08; 0, 27]	0,025
MUC4 (10/5)	0,85 [0, 64; 3, 88]	0,11 [0, 03; 0, 20]	0,029
MUC16 (9/5)	1,06 [0, 45; 2, 22]	0,16 [0, 07; 0, 29]	0,010
PLAU (10/5)	0,63 [0, 48; 4, 70]	0,17 [0, 12; 0, 23]	0,101
GPC1 (9/5)	1,18 [0, 16; 5, 33]	0,16 [0, 10; 0, 32]	0,1

FС (fold change) – кратность изменения экспрессии, Ме [IQR] – медиана и межквартильный размах, ПАК – протоковая аденокарцинома, ХП – хронический панкреатит

Различия считались статистически значимыми при p < 0,05

^* Фактическое количество образцов, для которых были получены детектируемые уровни экспрессии

 

Таблица 3. МикроРНК с дифференциальной экспрессией в образцах хронического панкреатита и протоковой аденокарциномы согласно критерию |log₂FC| ≥ 1,0 при p < 0,05, выявленные на этапе первичного анализа различия, при множественном тестировании (p_adj < 0,05) которых не был достигнут порог статистической значимости

№	микроРНК	logCPM	log2FC	Направление экспрессии*	Значение p
1	hsa-miR-146а-5p	11,208	2,993	Повышена	0,0001
2	hsa-miR-135-5p	5,452	-4,590	Понижена	0,002
3	hsa-miR-181c-5p	3,582	-6,483	Понижена	0,004
4	hsa-miR-196-5p	4,279	-7,311	Понижена	0,004
5	hsa-miR-205-5p	8,687	-11,885	Понижена	0,003
6	hsa-miR-335-3p	6,218	-2,520	Понижена	0,005
7	hsa-miR-184-3p	5,130	-4,590	Понижена	0,009
8	hsa-miR-31-5p	9,433	-3,207	Понижена	0,014
9	hsa-miR-577-5p	5,827	-2,482	Понижена	0,013
10	hsa-miR-8a-5p	2,873	-5,555	Понижена	0,009
11	hsa-miR-8b-3p	6,873	-2,410	Понижена	0,012
12	hsa-miR-8a-3p	11,307	-2,672	Понижена	0,015
13	hsa-miR-10a-5p	15,296	-2,218	Понижена	0,021
14	hsa-miR-155-5p	6,560	1,491	Повышена	0,019
15	hsa-miR-203-3p	8,099	-2,577	Понижена	0,019
16	hsa-miR-22a-3p	7,592	1,160	Повышена	0,021
17	hsa-miR-28-3p	3,221	-3,546	Понижена	0,021
18	hsa-miR-378-3p	10,680	1,604	Повышена	0,021
19	hsa-miR-92c-3p	9,221	-1,422	Понижена	0,023
20	hsa-miR-342-3p	7,592	1,180	Повышена	0,031
21	hsa-miR-335-5p	6,735	-1,067	Понижена	0,035

logCPM (log counts per million) – логарифм нормализованных значений экспрессии, log_٢FC (log_٢ fold change) – логарифм отношения экспрессии

^* Направление экспрессии указано для протоковой аденокарциномы поджелудочной железы относительно хронического панкреатита

 

Таблица 4. Характер функциональных связей между мРНК PKM, MUC1 и ITGA2 и восьмью дифференциально экспрессируемыми микроРНК

МикроРНК	Количество взаимодействий «микроРНК – мРНК»	Степень связанности в сети взаимодействия «микроРНК – мРНК»
hsa-miR-335-5p	2711	9809622
hsa-miR-155-5p	971	3887336
hsa-miR-335-3p	325	1423970
hsa-miR-342-3p	325	1386129
hsa-miR-31-5p	239	872162,3
hsa-miR-205-5p	197	768289,4
hsa-miR-22-3p	184	738096
hsa-miR-28-3p	60	230686

Оценка выполнена на основе данных о количестве взаимодействий «микроРНК – мРНК» в сети и степени их связанности, представляющего собой численный показатель количества связей, которые соединяют данный узел с другими узлами сети

 

Наиболее обогащенные молекулярные пути по данным функциональной аннотации in silico шести дифференциально экспрессированных генов с использованием базы данных Gene Ontology в онлайн-платформе ShinyGo 0.85. Fold enrichment – показатель, характеризующий превышение доли генов с определенной функцией в исследуемой выборке по сравнению с геномом в целом. Цветовая шкала полос соответствует степени статистической значимости: от зеленого (пороговое значение FDR = 0,05; -log₁₀ = 1,30) до оранжевого (максимальная статистическая значимость; -log₁₀ = 1,55). FDR (false discovery rate) – средняя доля ложноположительных результатов

 

Дополнительная информация

Финансирование

Поисково-аналитическая работа по подготовке рукописи проведена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации (соглашение № 126020916809-4).

Конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов

О.А. Фрейлихман – концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, написание текста, статистическая обработка данных; С.Ш. Сейфединова – концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, анализ результатов, написание текста, статистическая обработка данных; И.Н. Данилов – редактирование текста, утверждение итогового варианта текста рукописи; А.А. Костарева – концепция и дизайн исследования, утверждение итогового варианта текста рукописи; Е.Г. Солоницын – концепция и дизайн исследования, редактирование текста; О.В. Калинина – концепция и дизайн исследования, редактирование текста, утверждение итогового варианта текста рукописи. Все авторы прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией, согласны нести ответственность за все аспекты работы и гарантируют, что ими надлежащим образом были рассмотрены и решены вопросы, связанные с точностью и добросовестностью всех частей работы.

About the authors

Olga A. Freylikhman

Almazov National Medical Research Centre

Email: olga1-7@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2850-728X

PhD (in Biol.), Senior Research Fellow, Research Laboratory of Microvesicular Transport, Institute of Molecular Biology and Genetics

Russian Federation, 2 Akkuratova ul., Saint-Petersburg, 197341

Sabina Sh. Seyfedinova

Almazov National Medical Research Centre

Email: seysabina000@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3389-5309

MD, Endoscopist, Endoscopy Department with Clinic

Russian Federation, 2 Akkuratova ul., Saint-Petersburg, 197341

Ivan N. Danilov

Almazov National Medical Research Centre

Email: ivandanilov75@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9540-7812

MD, PhD, Head of the Department of Faculty Surgery with Clinic, Institute of Medical Education

Russian Federation, 2 Akkuratova ul., Saint-Petersburg, 197341

Anna A. Kostareva

Almazov National Medical Research Centre

Email: akostareva@hotmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9349-6257

Doctor of Biol. Sci., Professor, Department of Faculty Therapy with Clinic, Institute of Medical Education; Head of the Institute of Molecular Biology and Genetics

Russian Federation, 2 Akkuratova ul., Saint-Petersburg, 197341

Evgeny G. Solonitsyn

Almazov National Medical Research Centre

Email: mail@esolonitsyn.ru
ORCID iD: 0000-0002-0794-232X

MD, PhD, Associate Professor, Department of Faculty Surgery with Clinic, Institute of Medical Education

Russian Federation, 2 Akkuratova ul., Saint-Petersburg, 197341

Olga V. Kalinina

Almazov National Medical Research Centre

Author for correspondence.
Email: olgakalinina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1916-5705

Doctor of Biol. Sci., Professor, Department of Laboratory Medicine with Clinic, Institute of Medical Eductaion

Russian Federation, 2 Akkuratova ul., Saint-Petersburg, 197341

References

Supplementary files